耐多藥大腸埃希菌質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因探討.pdf

1、目的：探討瀘州地區(qū)質(zhì)粒介導(dǎo)的產(chǎn)ESBLs(extended–sperectrumβ-lactmases)耐多藥大腸埃希菌TEM,SHV,CTX-M,CTX-M-3,CTX-M-22、CTX-M-24等6種耐藥酶基因分布狀況和對(duì)常見抗生素的耐藥情況,為臨床治療大腸埃希菌感染合理選用抗菌藥物提供理論依據(jù)。
　　方法：1.紙片擴(kuò)散法(Kerby-Bauer法,K-B法):采用美國(guó)全國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(the National Comm

2、ittee For Clinical Laboratory Standards,NCCLS)推薦的該方法測(cè)定71株大腸埃希菌對(duì)常見的氨基糖苷類,氟喹諾酮類,第三代頭孢菌素類抗生素的耐藥性。該實(shí)驗(yàn)方法要點(diǎn):將接種于M-H(酪蛋白瓊脂)平板上(37℃孵育24小時(shí))的待測(cè)細(xì)菌制備成與0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管濁度相同的菌液,并把菌液均勻涂布于滅菌的Mueller-Hinton培養(yǎng)基表面,數(shù)分鐘干燥后,用無菌鑷將藥敏紙片分別平貼于M-H培養(yǎng)基表面,每張紙

3、片間距離不少于25mm,紙片中心距離平皿邊緣不少于15mm。將貼有紙片的平皿于37℃孵育24小時(shí)后,用毫米尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑,抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限,抑菌環(huán)直徑的大小反映了測(cè)試細(xì)菌對(duì)測(cè)定抗生素的敏感程度。大腸埃希菌菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922進(jìn)行質(zhì)控對(duì)照。2.PCR技術(shù):采用質(zhì)粒小提試劑盒制備質(zhì)粒DNA擴(kuò)增模板;2×TaqPCRMasterMix,6種靶基因PCR擴(kuò)增體系均為:每一個(gè)PCR反應(yīng)體系共35ul,其中模板7u

4、l,引物1對(duì)各5ul,2×TaqPCRMasterMix15ul,ddH2O8ul。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性3min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共30個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳,以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922進(jìn)行陰性對(duì)照。用紫外線檢測(cè)儀分析結(jié)果并用凝膠成像儀攝像;3.PCR產(chǎn)物測(cè)序:PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序儀檢測(cè)堿基序列,與已知的6種基因序列相比較。

5、　　結(jié)果：1.藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果:臨床分離的71株大腸埃希菌中,全敏6株(8.57%);單耐16株(22.86%);雙耐19株(27.14%);耐多藥30株(42.86%)。2.耐多藥單酶基因檢測(cè)結(jié)果:TEM有11株(36.67%);SHV僅1株(3.33%),所占比例較低;CTX-M有23株(76.67%);CTX-M-3有21株(70%),CTX-M-22有錯(cuò)誤!未找到引用源。9株(12.86%);CTX-M-24有錯(cuò)誤!未找到引用源。2

6、4株(80%)。3.耐多藥多酶基因檢測(cè)結(jié)果:含2種酶基因同時(shí)檢出的有30株(其中CTX-M+CTX-M-3有12株(40%);CTX-M-24+CTX-M有12株(40%);CTX-M-22+CTX-M-24有6株(20%),含3種耐藥酶基因共檢出13株(32.5%),含5種耐藥酶基因有1株(3.33%),未發(fā)現(xiàn)上述6種耐藥性質(zhì)粒酶基因3株(10.00%)。CTX-M類基因(包括CTX-M,CTX-M-3,CTX-M-22,CTX-M-

7、24)和SHV,TEM類基因的檢出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。攜CTX-M-24,CTX-M-3,TEM,CTX-M,CTX-M-24+CTX-M基因的菌株對(duì)AMK和TM的療效具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);攜帶TEM,CTX-M,CTX-M-3基因的菌株對(duì)CFX和CPZ的療效具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：瀘州地區(qū)耐多藥大腸埃希菌存在質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM、SHV、CTX-M、CTX-M-3、CTX-M-22、CTX