ampC與喹諾酮類靶位基因突變?cè)谀投嗨幋竽c埃希菌中的探討.pdf

1、目的:了解瀘州地區(qū)大腸埃希菌(Escherichia coli，E.coli)攜帶ampC基因及耐喹諾酮類突變靶位基因的情況，并對(duì)二者的相關(guān)性進(jìn)行探討;同時(shí)分析攜帶突變基因的菌株對(duì)喹諾酮類抗菌藥物的耐藥情況，為臨床治療耐多藥菌株的合理選擇抗菌藥物提供理論依據(jù)。
　　方法:1.PCR技術(shù):使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒按使用說明提取細(xì)菌基因組DNA用作PCR反應(yīng)模板。5對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并于254nm波長(zhǎng)的

2、紫外燈下用圖像處理器照相。2.基因測(cè)序:將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物用核酸定量?jī)x測(cè)DNA濃度合格（大于300ng/μl）后，送至上海生工技術(shù)公司進(jìn)行基因測(cè)序。3.藥物敏感試驗(yàn):3.1鑒定高產(chǎn)AmpC酶菌株:經(jīng)過檢測(cè)菌株對(duì)頭孢西丁的抑菌環(huán)≤18mm為可疑產(chǎn)AmpC酶菌株，再通過頭孢西丁三維試驗(yàn)方法，通過檢測(cè)大腸埃希菌的β-內(nèi)酰胺酶能否水解頭孢西?。ㄎg環(huán)現(xiàn)象）來確證產(chǎn)酶菌株。3.2紙片擴(kuò)散法(Kerby-Bauer，K-B):測(cè)定臨床分

3、離株大腸埃希菌對(duì)氧氟沙星(OFX)、洛美沙星(LOM)、環(huán)丙沙星(CIP)、萘啶酸(NA)、諾氟沙星(NOR)、頭孢西丁(FOX)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢吡肟(FEP)、氨曲南(ATM)、亞胺培南(IPM)、鏈霉素(S)、慶大霉素(GEN)等抗菌藥物的敏感性。
　　結(jié)果:1.ampC基因攜帶:71株大腸埃希菌檢出ampC基因陽性61株(85.92％)。2.喹諾酮靶位基因突變:選出5種基因電泳均見清晰條帶的55株菌株的基因產(chǎn)物進(jìn)行

4、測(cè)序比對(duì)，GyrA亞基49株出現(xiàn)S83L位氨基酸替換、36株出現(xiàn)D87N位氨基酸替換;GyrB亞基3株出現(xiàn)基因突變但未出現(xiàn)氨基酸替換;ParC亞基34株出現(xiàn)S80I替換及8株A56P替換;ParE亞基6株出現(xiàn)E84G替換、4株A426V替換及3株S458A替換。同時(shí)存在ampC基因陽性且喹諾酮類靶位基因突變菌株有51株(92.72％)。3.產(chǎn)AmpC酶情況:61株ampC基因陽性株中有10株(16.39％)對(duì)頭孢西丁藥敏紙片抑菌環(huán)≤18

5、mm。確證產(chǎn)AmpC酶菌株8株(13.11％)。4.藥敏結(jié)果:(1)實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)亞胺培南敏感性最高，達(dá)100％，其次是頭孢西丁、頭孢吡肟、氨曲南等抗菌藥物，而較低的是部分喹諾酮類抗菌藥物及頭孢噻肟、慶大霉素、鏈霉素等。(2) ampC基因陽性菌株對(duì)NA、NOR、OFX三種抗菌藥物的耐藥率高于ampC基因陰性菌株(P＜0.05)。高產(chǎn)AmpC酶對(duì)CIP的耐藥率高于非產(chǎn)AmpC酶菌株(P＜0.05)。(3)55株測(cè)序菌株中，耐多藥大腸埃希菌有

6、21株(38.18％)，其中同時(shí)存在ampC基因陽性且喹諾酮類靶位基因出現(xiàn)突變的菌株占71.43％，產(chǎn)AmpC酶菌株占38.10％。另外，菌株對(duì)喹諾酮類藥物的交叉耐藥現(xiàn)象也比較常見，耐三種及以上喹諾酮類抗菌藥物的菌株有22株(40％)。(4)耐多藥菌株中突變耐藥位點(diǎn)與雙耐藥相比較差距不大，但不同的是出現(xiàn)了ampC陽性聯(lián)合gyrA+parC+parE基因的突變，而全敏和單耐菌株僅表現(xiàn)為單個(gè)耐藥位點(diǎn)的突變。
　　結(jié)論:1.本地區(qū)臨床分

7、離的大腸埃希菌中攜帶ampC基因的菌株常見(85.92％)，且在耐多藥菌株中占90.48％，高產(chǎn)AmpC酶菌株相對(duì)較少(11.27％)，但主要分布在耐多藥大腸埃希菌中。2.喹諾酮類靶位基因突變情況在臨床分離株中常見，多位點(diǎn)突變以gyrA聯(lián)合parC基因的突變?yōu)橹?，耐多藥菌株中，多位點(diǎn)突變以ampC陽性聯(lián)合gyrA及parC基因的突變?yōu)橹鳌?.ampC基因檢出陽性菌株對(duì)萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星耐藥性高于ampC基因檢出陰性菌株，高產(chǎn)Am