小檗堿提取物抑制多重耐藥大腸埃希菌外排喹諾酮類藥物的研究.pdf

1、近年來(lái)，由于病原菌特別是大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥物(Qs)耐藥性日益嚴(yán)重，使得Qs臨床治療效果嚴(yán)重降低，造成治療成本升高、養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)增大、藥物使用劑量加大、導(dǎo)致藥物殘留等食品安全問(wèn)題。因此，如何提高Qs的治療效果，不僅事關(guān)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，更是關(guān)乎食品安全乃至人類健康的社會(huì)問(wèn)題。從Qs耐藥性的產(chǎn)生特點(diǎn)及能否逆轉(zhuǎn)的角度，耐藥性控制和逆轉(zhuǎn)的研究主要集中在新藥開(kāi)發(fā)與篩選理想的外排抑制劑上。新藥研發(fā)需要耗費(fèi)大量的人力、物力、財(cái)力與時(shí)間，且開(kāi)發(fā)出的新藥

2、又可能很快產(chǎn)生耐藥性，因此很難及時(shí)解決當(dāng)前日益嚴(yán)重的耐藥性問(wèn)題。外排抑制劑是能夠消除細(xì)菌等多重耐藥性的一類物質(zhì)，通過(guò)有效抑制主體的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（外排泵）活性，包括細(xì)菌、癌細(xì)胞等，減少藥物排出量。中藥有效成分相對(duì)安全、殘留小、無(wú)耐藥性危害等，在產(chǎn)品研發(fā)與臨床應(yīng)用上具有明顯優(yōu)勢(shì)，所以具有外排抑制活性的天然藥物不僅能夠提高由外排泵介導(dǎo)耐藥病原菌對(duì)藥物的敏感性，還有利于減少由外排作用促進(jìn)的耐藥突變株的產(chǎn)生，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于耐藥菌感染

3、的治療以及畜牧業(yè)的健康發(fā)展有著深遠(yuǎn)的意義。本試驗(yàn)通過(guò)前期篩選的中藥十大功勞為研究對(duì)象，提取其主要有效成分小檗堿，研究其是否具有抑制多重耐藥大腸埃希菌外排喹諾酮類藥物的作用，為后期外排泵抑制劑的確認(rèn)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為新外排抑制劑的研制提供理論依據(jù)。
　　 1、小檗堿提取物的制備
　　 采用乙醇回流提取法提取十大功勞中的有效成分小檗堿，并參照藥典方法對(duì)小檗堿提取物進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。

4、r>　　 結(jié)果:乙醇回流提取法提取十大功勞中小檗堿的提取率為1.2％;經(jīng)鑒別均符合2010版中國(guó)藥典中鹽酸小檗堿項(xiàng)下的鑒別試驗(yàn);小檗堿對(duì)照品溶液回歸方程為:A=170931C+167702，線性范圍15～135μg/mL(r=0.9996)，測(cè)得所制備的小檗堿提取物含量為97.3％。
　　 結(jié)論:采用乙醇回流提取法提取小檗堿，經(jīng)精制后小檗堿的純度達(dá)到97.3％，該方法具有可行性;本試驗(yàn)所建立的高效液相色譜檢測(cè)法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可

5、作為小檗堿提取物的含量測(cè)定方法。
　　 2、小檗堿提取物體外抑菌試驗(yàn)
　　 采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的肉湯稀釋法，分別測(cè)定乳酸環(huán)丙沙星(Cip)及小檗堿提取物對(duì)質(zhì)控菌ATCC25922及耐藥菌73-2的最小抑菌濃度(MIC)，并將小檗堿提取物與乳酸環(huán)丙沙星聯(lián)合，檢測(cè)其對(duì)乳酸環(huán)丙沙星抑菌效果的影響，以能量抑制劑碳酰氰間氯苯腙(CCCP)作為藥物對(duì)照。
　　 結(jié)果:乳酸環(huán)丙沙星對(duì)質(zhì)控菌ATCC2

6、5922及耐藥菌73-2的MIC值分別為0.0078μg/mL和256μg/mL，小檗堿提取物對(duì)質(zhì)控菌ATCC25922及耐藥菌73-2的MIC值分別為＞500mg/mL和＞500mg/mL。小檗堿提取物與乳酸環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用，表現(xiàn)為乳酸環(huán)丙沙星對(duì)質(zhì)控菌ATCC25922的MIC值沒(méi)有變化，對(duì)耐藥菌73-2的MIC值變?yōu)?μg/mL，降為原來(lái)的1/64;CCCP與乳酸環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用，表現(xiàn)為乳酸環(huán)丙沙星對(duì)質(zhì)控菌ATCC25922的MIC

7、值沒(méi)有變化，對(duì)耐藥菌73-2的MIC值變?yōu)?μg/mL，降為原來(lái)的1/32。
　　 結(jié)論:小檗堿提取物聯(lián)合乳酸環(huán)丙沙星能夠提高耐藥大腸埃希菌對(duì)乳酸環(huán)丙沙星的敏感性，表現(xiàn)出良好的耐藥抑制作用，且效果優(yōu)于CCCP。
　　 3、小檗堿提取物對(duì)受試菌株乳酸環(huán)丙沙星蓄積量的影響
　　 采用高效液相色譜法分別檢測(cè)質(zhì)控菌ATCC25922與耐藥菌73-2加與未加小檗堿提取物，細(xì)菌體內(nèi)乳酸環(huán)丙沙星(Cip)的蓄積量，并以CCCP

8、作為藥物對(duì)照。
　　 結(jié)果:加入小檗堿提取物后，質(zhì)控菌體內(nèi)乳酸環(huán)丙沙星蓄積量幾乎無(wú)變化，耐藥菌73-2菌體內(nèi)乳酸環(huán)丙沙星蓄積量明顯增加，約為未加小檗堿提取物組的2.62倍;加入CCCP后，質(zhì)控菌體內(nèi)乳酸環(huán)丙沙星蓄積量幾乎無(wú)變化，耐藥菌73-2菌體內(nèi)乳酸環(huán)丙沙星蓄積量明顯增加，約為未加CCCP組的2.25倍。
　　 結(jié)論:小檗堿提取物與CCCP均可以增加耐藥菌73-2菌體內(nèi)乳酸環(huán)丙沙星的蓄積量，表現(xiàn)出良好的外排抑制作用，且