粉防己甲素逆轉(zhuǎn)多重耐藥大腸埃希菌外排喹諾酮類藥物機(jī)制的研究.pdf

1、抗生素和其他抗菌藥物的發(fā)展可以說是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)最偉大的成就，它增加了人類的平均壽命。但是，過度使用和濫用抗生素及抗菌藥已導(dǎo)致了微生物的耐藥性。喹諾酮類抗菌藥在人類和動(dòng)物的臨床使用上有著極其重要的作用。然而細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性卻日趨嚴(yán)重，特別是大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥率呈逐年增高的趨向?，F(xiàn)如今，喹諾酮類藥物的臨床治療效果低下，使用劑量大、治療成本高等諸多問題擺在我們面前。如果能控制或解決細(xì)菌耐藥性的問題，無疑是醫(yī)學(xué)界的一重大成果，

2、可以大大提高現(xiàn)有抗菌藥的抗菌效果。當(dāng)前，為應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥性問題，研究比較多的是關(guān)于細(xì)菌外排泵抑制劑的研究，如利血平、維拉帕米、碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙（CCCP）等，但由于其毒副作用很難應(yīng)用于臨床。近年來發(fā)現(xiàn)的天然植物活性成分如小檗堿、胡椒堿等也被證實(shí)擁有抑制外排泵的作用。中藥有效成分相對(duì)安全、殘留小、無耐藥性危害等，在產(chǎn)品研發(fā)與臨床應(yīng)用上具有明顯優(yōu)勢。本試驗(yàn)通過結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)室的研究，選擇中藥防己的主要有效成分粉防己甲素，研究其是否具有抑制多

3、重耐藥大腸埃希菌外排喹諾酮類藥物的效果，為后期外排泵抑制劑的確認(rèn)奠定基礎(chǔ)；同時(shí)通過對(duì)耐藥菌逆轉(zhuǎn)機(jī)制的初步探究，為粉防己甲素外排抑制劑的研制提供理論依據(jù)。
　　1、粉防己甲素對(duì)臨床分離耐藥大腸埃希菌的逆轉(zhuǎn)作用
　?、俨捎寐?lián)合藥敏試驗(yàn)測定粉防己甲素對(duì)乳酸環(huán)丙沙星抑菌效果的影響；②使用不同濃度的乳酸環(huán)丙沙星HM肉湯進(jìn)行耐藥菌73-2殺菌試驗(yàn)，繪制乳酸環(huán)丙沙星以及聯(lián)合粉防己甲素和CCCP對(duì)耐藥菌73-2的殺菌曲線；③使用含粉防己甲素

4、和不同濃度乳酸環(huán)丙沙星的含藥MH瓊脂平皿測定在粉防己甲素存在下大腸埃希菌ATCC25922的突變率；④采用高效液相色譜法分別檢測耐藥菌73-2和大腸埃希菌ATCC25922在粉防己甲素條件下，細(xì)菌體內(nèi)乳酸環(huán)丙沙星的蓄積量，試驗(yàn)以CCCP作為藥物對(duì)照；⑤使用含粉防己甲素的LB肉湯反復(fù)培養(yǎng)耐藥菌73-2，以獲得敏感性恢復(fù)的逆轉(zhuǎn)細(xì)菌。
　　結(jié)果：乳酸環(huán)丙沙星聯(lián)合粉防己甲素對(duì)大腸埃希菌73-2的FIC指數(shù)為0.1875，具有較強(qiáng)的協(xié)同作用

5、，使用160μg/mL的粉防己甲素和10μg/mL的CCCP與乳酸環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用，乳酸環(huán)丙沙星對(duì)耐藥菌73-2的最小抑菌濃度（MIC）均由聯(lián)合前的320μg/mL降低到10μg/mL，而對(duì)大腸埃希菌ATCC25922的MIC值無影響；粉防己甲素可以提高1/2MIC濃度的乳酸環(huán)丙沙星對(duì)耐藥菌73-2的殺滅作用，抑制細(xì)菌的生長；在4MIC濃度的乳酸環(huán)丙沙星條件下粉防己甲素可以有效降低大腸埃希菌ATCC25922的突變，突變率從正常的10-

6、7降低到10-9；在粉防己甲素存在條件下，耐藥菌73-2細(xì)胞體內(nèi)乳酸環(huán)丙沙星的蓄積量明顯比正常情況明顯增加，約為4.2倍，而對(duì)大腸埃希菌ATCC25922幾乎無影響，在CCCP存在條件下，也出現(xiàn)相似情況，耐藥菌73-2乳酸環(huán)丙沙星的蓄積量約是正常條件下的3.9倍；通過使用含粉防己甲素的肉湯培養(yǎng)耐藥菌得到了乳酸環(huán)丙沙星對(duì)其MIC下降的菌株B（Tet）。
　　結(jié)論：粉防己甲素具有增強(qiáng)乳酸環(huán)丙沙星殺滅細(xì)菌的作用，可以抑制細(xì)菌的突變，增加

7、乳酸環(huán)丙沙星在耐藥菌細(xì)胞內(nèi)的蓄積量。粉防己甲素具有外排抑制劑的活性。
　　2、粉防己甲素對(duì)臨床分離耐藥大腸埃希菌的逆轉(zhuǎn)機(jī)制研究
　　檢測正常生長的耐藥菌73-2和在粉防己甲素條件下生長的耐藥菌73-2及正常生長的耐藥逆轉(zhuǎn)菌B（Tet）外排泵基因acrA、acrB、tolC、acrZ及其調(diào)控基因marA、rob、acrR mRNA的表達(dá)量；檢測逆轉(zhuǎn)菌B（Tet）在逆轉(zhuǎn)前后外排泵基因acrA/B/Z、tolC和調(diào)控基因marA、

8、acrR、rob的堿基序列。
　　結(jié)果：在粉防己甲素存在下生長的耐藥菌73-2（Tet）和耐藥逆轉(zhuǎn)的細(xì)菌B（Tet）和耐藥菌73-2外排泵基因acrA/B/Z mRNA的表達(dá)量比較都極顯著下降；tolC mRNA的表達(dá)量73-2（Tet）只是下降，B（Tet）表現(xiàn)為極顯著下降。對(duì)外排泵起正調(diào)控作用的marA、rob mRNA表達(dá)量都極顯著減少；B（Tet）表現(xiàn)出負(fù)調(diào)控基因acrR mRNA表達(dá)量顯著上升，而73-2（Tet）acr

9、R mRNA表達(dá)量的只是上升。耐藥逆轉(zhuǎn)菌B（Tet）的相關(guān)基因堿基序列和耐藥菌73-2相比均未發(fā)生改變。
　　結(jié)論：粉防己甲素對(duì)耐藥大腸埃希菌的外排泵基因acrA/B/Z和正調(diào)控基因marA、rob的表達(dá)具有顯著的抑制作用，可以促進(jìn)負(fù)調(diào)控基因acrR的表達(dá)。不能使耐藥菌的外排泵基因acrA/B/Z、tolC和調(diào)控基因marA、rob、acrR的堿基序列再次發(fā)生突變。粉防己甲素可以通過影響外排泵的表達(dá)逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性。
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10、、粉防己甲素對(duì)體外誘導(dǎo)耐藥菌AcrAB-TolC外排泵的作用
　　采取多步法，以1/2MIC濃度的乳酸環(huán)丙沙星體外人工誘導(dǎo)大腸埃希菌ATCC25922產(chǎn)生耐藥性；將乳酸環(huán)丙沙星與粉防己甲素聯(lián)合應(yīng)用，檢測粉防己甲素是否具備逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)菌耐藥性的作用；檢測在粉防己甲素條件下生長的誘導(dǎo)菌 A（Cip）外排泵基因acrA/B/Z、tolC mRNA的表達(dá)量。
　　結(jié)果：以1/2MIC為起點(diǎn)人工體外誘導(dǎo)獲得了能穩(wěn)定遺傳的耐藥菌 A（Cip