體外誘導(dǎo)哈維氏弧菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）主要分布于海洋環(huán)境和海洋生物體中，是多種海洋魚類和無(wú)脊椎動(dòng)物的條件致病菌。弧菌病的防治主要依賴于抗生素和化學(xué)藥物，喹諾酮類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛，水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌對(duì)此類藥物的耐藥性日趨顯著。目前，缺乏哈維氏弧菌對(duì)于喹諾酮藥物耐藥機(jī)制的相關(guān)研究。
　　本研究以哈維氏弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33843和臨床分離的敏感菌株為研究對(duì)象，在含亞抑菌濃度諾氟沙星的培養(yǎng)基上進(jìn)行逐步誘導(dǎo)，分別對(duì)誘導(dǎo)前

2、后菌株耐藥性和生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果成功篩選了兩株高水平喹諾酮耐藥菌株（MIC為512～1024μg/ml），耐藥性能穩(wěn)定遺傳并且呈現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象。耐藥株與敏感株相比泳動(dòng)能力和生物膜形成能力均顯著上升，生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯變化。
　　利用PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序的方法檢測(cè)各誘導(dǎo)菌株靶基因gyrA、gyrB、parC、parE的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)，并加入外排泵抑制劑(CCCP)抑制細(xì)菌主動(dòng)外排系統(tǒng)，測(cè)定不同藥物對(duì)細(xì)菌的MIC。結(jié)果

3、顯示隨著誘導(dǎo)菌株MIC值的不斷增加，靶基因上逐漸產(chǎn)生了突變，先是gyrA第83位Ser發(fā)生單點(diǎn)突變?yōu)镮le，之后parC基因上的第85位Ser突變?yōu)門yr或Phe，gyrB和parE未檢測(cè)到突變。加入CCCP后，耐藥菌的MIC值均有所下降。提示哈維氏弧菌對(duì)喹諾酮類耐藥可能存在靶基因突變及外排泵等多種耐藥機(jī)制。
　　通過RNA-seq技術(shù)對(duì)臨床分離的哈維氏弧菌的敏感菌株(VS)和耐藥株(VR)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)從頭拼接(De n

4、ove)再組裝共得到2，082條Unigene。通過比對(duì)，兩個(gè)樣品共鑒定出129個(gè)差異表達(dá)基因，耐藥菌與敏感菌相比有65個(gè)基因上調(diào)，64個(gè)下調(diào)。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，發(fā)現(xiàn)雙組份系統(tǒng)(ko02020)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(ko02010)、鞭毛組裝(ko02040)通路顯著富集，并找到與喹諾酮耐藥相關(guān)的9個(gè)基因。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示哈維氏弧菌的耐藥機(jī)制除了經(jīng)典的靶位點(diǎn)突變外，主動(dòng)外排系統(tǒng)、雙組份系統(tǒng)與鞭毛組裝等調(diào)節(jié)機(jī)制也參與耐藥

5、的形成。
　　利用RT-PCR技術(shù)在優(yōu)化的熒光定量PCR的反應(yīng)條件下對(duì)10個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析的基因表達(dá)趨勢(shì)基本一致，證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)據(jù)分析的可靠性。
　　對(duì)預(yù)測(cè)的哈維氏弧菌喹諾酮耐藥基因qnr進(jìn)行克隆和原核表達(dá)優(yōu)化，結(jié)果表明哈維氏弧菌qnr全長(zhǎng)651bp，編碼216個(gè)氨基酸;重組蛋白優(yōu)化條件為28℃、IPTG濃度為0.05 mmol/L條件下誘導(dǎo)6h。獲得的哈維氏弧菌QNR蛋白為下一