環(huán)境喹諾酮類藥物耐藥基因的檢測方法及其應(yīng)用.pdf

1、抗生素從發(fā)現(xiàn)開始，已經(jīng)被廣泛使用于臨床、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和畜牧業(yè)等。在抗生素被廣泛使用的同時，大量的抗生素被持續(xù)不斷地排放至環(huán)境當(dāng)中，從而造成一系列的環(huán)境問題。微生物的耐藥性作為最為重要的問題之一已經(jīng)成為環(huán)境工作者關(guān)注的熱點。 本研究以北京溫榆河流域水樣為研究對象，調(diào)查了環(huán)境中E．coli(大腸桿菌)對喹諾酮的耐藥情況。其中的工作包括革蘭氏陰性菌總DNA的耐藥基因分析，耐喹諾酮E．coli的發(fā)生率的調(diào)查，E．coli耐喹諾酮能力的檢測，

2、耐藥突變位點分析及E．coli的致病因子檢測。 在本研究中沿溫榆河流域設(shè)計了12個采樣點，通過PCR與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合的方法，檢測了過夜培養(yǎng)后的濾膜上，革蘭氏陰性菌總DNA中對三種抗生素的耐藥基因，即抗磺胺類(sulI、sulII、sulIII)、四環(huán)素類(tetA、tetB、tetM)、β—內(nèi)酰胺酶類(TEM)基因。結(jié)果表明，磺胺類、四環(huán)素類、β—內(nèi)酰胺類類抗生素的耐藥基因在溫榆河流域被廣泛檢出。其中tetM在所有采樣點都呈

3、陰性，而1號、6號、8號、19號采樣點的耐藥基因有部分耐藥基因未檢出，包括tetA或sulIII；但其他采樣點5、12、18，20、25、26號，除tetM外全都呈陽性；昆明湖樣品位于生活區(qū)上游，屬于污染較少的區(qū)域，耐藥菌檢出率明顯低于其他地區(qū)，但除了tetM、sutIII，其他耐藥菌也有檢測出來。從各個采樣點耐藥基因的檢出狀況來看，這幾種抗生素的耐藥基因在溫榆河水體中具有一定的發(fā)生率和普遍性，其種類并不沿水體流向而增加或減少，可能受多

4、種環(huán)境條件的影響。 同時，本研究還以總DNA為模板擴(kuò)增出gyrA基因中喹諾酮耐藥決定區(qū)域(QRDR)，其DNA序列的測序結(jié)果用Bioedit軟件比對后發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列只有幾個無意突變位點，并沒有發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報道相應(yīng)的耐藥突變。 根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI，前稱為NCCLS)，大腸桿菌抗左氧氟沙星和加替沙星MIC達(dá)到8 ug/mL為耐藥，因而我們采用了不含抗生素的平板和含8 ug/mL的喹諾酮平板來培養(yǎng)濾膜上的E

5、．coli，通過平板計數(shù)法得知，沿溫榆河流域耐LEV的E．coli發(fā)生率在2.3％～31.3％之間，對GAT耐藥的發(fā)生率在0.8％～57.8％之間。為了進(jìn)一步確認(rèn)環(huán)境中喹諾酮耐藥性的發(fā)生，我們從各采樣點，不同喹諾酮梯度的濾膜上隨機(jī)篩選了共161株E．coli。 E．coli對喹諾酮類抗生素的耐藥性分析包括耐藥能力檢測及突變位點分析兩個方面。首先，鑒定E．coli耐藥能力，即最低抑菌濃度(MIC)的測定。本文采用瓊脂稀釋法測定了

6、每株菌對兩種喹諾酮的MIC，結(jié)果表明，E．coli對第三代喹諾酮LEV的MIC顯著高于對第四代喹諾酮GAT的MIC，有兩株E．coli對LEV的MIC甚至高達(dá)128 ug/mL，而E．coli對GAT也已經(jīng)有一定的耐藥性，MIC最高為32 ug/mL。其次，是對不同耐藥水平的E．coli的QRDR突變位點的分析，針對喹諾酮作用的機(jī)理，以gyrA基因和parC基因為目標(biāo)，尋找不同突變位點對E．coli的耐藥能力的貢獻(xiàn)。突變位點的分析結(jié)果表

7、明，gyrA基因中S83L突變的發(fā)生具有普遍性，并且有很多發(fā)生在MIC非常低的菌株中，而D87N突變則主要發(fā)生在LEV耐藥菌株中，推測是E．coli耐藥的一個關(guān)鍵位點；D87Y主要發(fā)生在對LEV的MIC在128 ug/mL和64 ug/mL中，表明該位點可能是E．coli具有很高的耐藥能力的關(guān)鍵因子。 耐藥E．coli中的耐藥基因及菌株作為一種環(huán)境污染，對各種人類及動物的健康都存在威脅，而E．coli的致病性更加劇了這種污染的危