反義策略阻斷外排泵出系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)多重耐藥銅綠假單胞菌及耐氟喹諾酮類大腸埃希桿菌耐藥性的研究.pdf

1、背景與目的：
　　銅綠假單胞菌和大腸埃希桿菌是引起臨床感染性疾病較常見的致病菌。由于抗生素的長(zhǎng)期大量使用，特別是不規(guī)范地濫用抗生素，導(dǎo)致了日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問題，細(xì)菌耐藥可導(dǎo)致患者感染率增加，感染持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，不恰當(dāng)治療增加，住院時(shí)間延長(zhǎng)，醫(yī)療費(fèi)用增加，甚至死亡率上升。多重耐藥銅綠假單胞菌(MDR-PA)有較高的感染率和病死率，是導(dǎo)致燒傷病人死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在我國(guó)耐喹諾酮類大腸埃希桿菌(FREC)的耐藥率處于全球前列，給臨床

2、治療疾病帶來困難，也給醫(yī)院感染控制提出了嚴(yán)峻的問題。因此，尋找一種新的控制MDR-PA及FREC感染的策略變得迫在眉睫。主動(dòng)泵出系統(tǒng)在MDR-PA及FREC的耐藥性產(chǎn)生方面起很關(guān)鍵的作用，MexAB-OprM是MDR-PA最主要的主動(dòng)泵出系統(tǒng)，無論是與MexAB共同起作用還是單獨(dú)起作用，由oprM基因編碼的外膜蛋白OprM對(duì)多重耐藥性的形成都起著非常重要的作用。AcrAB-TolC是大腸埃希桿菌的最主要的外排泵，AcrAB是決定細(xì)菌對(duì)氟

3、喹諾酮類藥物耐藥的重要機(jī)制。在本研究中我們以oprMmRNA和acrBmRNA為靶基因，設(shè)計(jì)合成選擇性針對(duì)oprMmRNA的硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs617)和針對(duì)acrBmRNA的硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs831)，制備納米微粒脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)，并通過該遞藥系統(tǒng)分別將PS-ODNs617和PS-ODNs831轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入MDR-PA和FREC細(xì)菌內(nèi)，旨在通過阻斷MexAB-OprM和AcrAB-TolC主動(dòng)泵出系統(tǒng)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)

4、MDR-PA及FREC的耐藥性，恢復(fù)兩類致病菌對(duì)常用抗生素對(duì)的敏感性。
　　方法：
　　1.聚乙烯亞胺(PEI)-硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs)納米微粒脂質(zhì)體的制備：以oprM和acrBmRNA為靶基因，設(shè)計(jì)合成針對(duì)oprMmRNA的硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs617)和針對(duì)acrBmRNA的硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs831)。將25KDa鏈狀PEI與PS-ODNs通過靜電相互作用制備成荷正電荷的聚乙烯亞

5、胺-硫代寡聚脫氧核苷酸納米微粒(PEI-ODN納米微粒)，將蛋黃卵磷脂(EPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)以14:0.9:1摩爾比混合后，用薄膜分散法制備包裹PEI-ODN納米微粒脂質(zhì)體；用粒徑分析儀測(cè)定納米微粒和脂質(zhì)體的平均粒徑；用葡聚糖凝膠過濾法分離未被包封的PEI-ODN納米微粒和脂質(zhì)體；紫外法測(cè)A260nm值計(jì)算脂質(zhì)體包封率；通過體外釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)估脂質(zhì)體穩(wěn)

6、定性。
　　2.選擇性抗oprMmRNA的PS-ODNs617逆轉(zhuǎn)MDR-PA耐藥性研究：用納米微粒脂質(zhì)體的方法將PS-ODNs617導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)菌落數(shù)(CFU)；測(cè)定PS-ODNs617對(duì)MDR-PA生長(zhǎng)的影響；測(cè)定給予PS-ODNs617后，不同抗生素對(duì)MDR-PA的最小抑菌濃度(MIC)的變化；通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)PS-ODNs617對(duì)基因oprM表達(dá)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)中PS-ODNs6

7、17設(shè)3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和100μg/ml四個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、空白脂質(zhì)體組、隨機(jī)鏈對(duì)照組PS-ODNs0701(100μg/ml)、游離PEI組(5.5μg/ml)和游離PS-ODNs617組(100μg/ml)。
　　3．選擇性抗acrBmRNA的PS-ODNs831逆轉(zhuǎn)FREC耐藥性研究：用納米微粒脂質(zhì)體的方法將PS-ODNs831導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)菌落數(shù)(CFU)；測(cè)定

8、PS-ODNs831對(duì)FREC生長(zhǎng)的影響；測(cè)定給予PS-ODNs831后，環(huán)丙沙星和左氧氟沙星對(duì)FREC的最小抑菌濃度(MIC)的變化；通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)PS-ODNs831對(duì)基因acrB表達(dá)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)中PS-ODNs831設(shè)3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和100μg/ml四個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、空白脂質(zhì)體組、隨機(jī)鏈對(duì)照組PS-ODNs0701(100μg/ml)、游離PEI組(5.5μg/ml

9、)和游離PS-ODNs831組(100μg/ml)。
　　結(jié)果：
　　1．PEI-ODN納米微粒脂質(zhì)體的制備：包裹PEI-ODN納米微粒的脂質(zhì)體的粒徑為(217.1±78.6)nm，平均包封率為(79.7?2.69)％。穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，將脂質(zhì)體混懸液放置于4℃和室溫14d后，脂質(zhì)體的載藥量分別為初始載藥量的76.32％和70.1％。將脂質(zhì)體混懸液放置于37℃2d后脂質(zhì)體的載藥量?jī)H為初始載藥量的61.69％，約40％的PS

10、-ODNs滲漏到脂質(zhì)體外，表明脂質(zhì)體在體內(nèi)37℃時(shí)有較好的釋藥率，可以緩慢將包裹的藥物釋放。
　　2.選擇性抗oprMmRNA的PS-ODNs617逆轉(zhuǎn)MDR-PA耐藥性研究：與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs617)的四個(gè)劑量組都能顯著抑制M-H瓊脂培養(yǎng)基上MDR-PA的生長(zhǎng)(P<0.01)，并隨著PS-ODNs617濃度的增加，抑制MDR-PA菌落生長(zhǎng)的作用增強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs617)的四個(gè)劑量組的哌拉西林都能顯

11、著抑制MDR-PA的生長(zhǎng)，并且具有濃度依賴性；實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs617)的四個(gè)劑量組都能使不同抗生素對(duì)MDR-PA的MIC值降低；real-timeRT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs617)的四個(gè)劑量組能明顯抑制oprMmRNA的表達(dá)(P<0.01)，并具有濃度依賴性抑制效應(yīng)。游離PS-ODNs617組(100μg/ml)與空白對(duì)照組相比其作用比較小，而空白脂質(zhì)體組、隨機(jī)鏈對(duì)照組PS-ODNs0701(100μg/ml)和游

12、離PEI組(5.5μg/ml)與空白對(duì)照組相比，其對(duì)MDR-PA的CFU、生長(zhǎng)測(cè)定、MIC和oprMmRNA的表達(dá)均沒有明顯的影響。
　　3.選擇性抗acrBmRNA的PS-ODNs831逆轉(zhuǎn)MDR-PA耐藥性研究：與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs831)的四個(gè)劑量組都能顯著抑制M-H瓊脂培養(yǎng)基上MDR-PA的生長(zhǎng)(P<0.01)，并隨著PS-ODNs831濃度的增加，抑制FREC菌落生長(zhǎng)的作用增強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs

13、831)的四個(gè)劑量組的環(huán)丙沙星和左氧氟沙星都能顯著抑制FREC的生長(zhǎng)，并且具有濃度依賴性；實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs831)的四個(gè)劑量組都能使環(huán)丙沙星和左氧氟沙星對(duì)FREC的MIC值降低至敏感；real-timeRT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組(PS-ODNs831)的四個(gè)劑量組能明顯抑制acrBmRNA的表達(dá)(P<0.01)，并具有濃度依賴性抑制效應(yīng)。游離PS-ODNs831組(100μg/ml)與空白對(duì)照組相比其作用比較小，而空白脂質(zhì)體組、隨

14、機(jī)鏈對(duì)照組PS-ODNs0701(100μg/ml)和游離PEI組(5.5μg/ml)與空白對(duì)照組相比，其對(duì)FERC的CFU、生長(zhǎng)測(cè)定、MIC和acrBmRNA的表達(dá)均沒有明顯的影響。
　　結(jié)論：
　　1．本研究制備的納米微粒脂質(zhì)體載藥量大、包封率高、穩(wěn)定性好，可以有效將硫代寡聚脫氧核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)到銅綠假單胞菌和大腸埃希桿菌菌體內(nèi)。
　　2．抗oprMmRNA的硫代寡聚脫氧核苷酸能夠選擇性抑MDR-PA細(xì)菌體內(nèi)MexAB-