大腸埃希菌aac（3）-Ⅱ耐藥基因的研究.pdf

1、自從上個(gè)世紀(jì)的青霉素工業(yè)化生產(chǎn)以來(lái),到目前已開(kāi)發(fā)了上千種抗菌素,并廣泛應(yīng)用于感染性疾病防治,取得顯著的效果,在醫(yī)學(xué)界曾以為有了抗菌素就徹底解決了感染性疾病防治問(wèn)題.但隨著抗菌素的大量使用和濫用,抗菌藥物治療所引起的非感染部位微生態(tài)菌群失常而導(dǎo)致的疾病,如偽膜性腸炎、陰道炎等疾病給人類造成了很大的危害.如果能及時(shí)分解或滅活進(jìn)入這些非感染部位的抗菌素,則可以避免或減少這種疾病.抗菌素伴侶的概念,就是可以清除在接受抗菌素治療時(shí)進(jìn)入非感染部位的

2、抗菌素,從而保護(hù)非感染部位正常菌群和微生態(tài)平衡的制劑. 本研究課題從反向思維考慮,目的在于將嚴(yán)重影響抗菌藥物防治效果的抗菌素耐藥酶開(kāi)發(fā)成為抗菌素伴侶.目前認(rèn)為,細(xì)菌對(duì)抗菌素耐藥的機(jī)制大多是細(xì)菌產(chǎn)生了能分解或滅活抗菌素的酶,如β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類修飾酶等.利用耐藥酶滅活相應(yīng)抗菌素的特性,使到達(dá)非感染部位的抗菌藥物濃度得到減少或清除,從而使這些微生態(tài)區(qū)域(如腸道、陰道等)的正常微生物群避免遭抗菌藥物的作用,從而達(dá)到保護(hù)人體微生態(tài)環(huán)境正常

3、菌群的目的. 本實(shí)驗(yàn)作為研究課題的一部分,主要研究了細(xì)菌對(duì)氨基糖苷抗生素耐藥機(jī)制中最常見(jiàn)和最重要的氨基糖苷類修飾酶--氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶(3)-Ⅱ(從C(3)-Ⅱ).在第一部分作為臨床基礎(chǔ)性研究,主要分析了從臨床分離的大腸埃希菌的耐藥譜,為臨床治療提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室資料和為本科題提供臨床資料;在第二部分以aac(3)-Ⅱ基因?yàn)檠芯繉?duì)象,將該基因克隆到載體pET26b中表達(dá);同時(shí)將aac(3)-Ⅱ基因和tem-116基因用一柔性肽連

4、接后表達(dá),以研究融合酶的活性;采用分子進(jìn)化技術(shù)定向進(jìn)化aac(3)-Ⅱ基因以提高其活性,為進(jìn)一步提高酶活的研究以及新型抗生素的研發(fā)作相應(yīng)的基礎(chǔ)工作. 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn),我們得到如下結(jié)果:①54株大腸埃希菌對(duì)阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、鏈霉素、大觀霉素和奈替米星的耐藥率分別為14.8﹪、77.8﹪、59.3﹪、66.7﹪、68.5﹪、61.1﹪、22.2﹪;共檢測(cè)出產(chǎn)ESBLs菌株34株,占63.0﹪.耐氨基糖苷類抗生素的

5、大腸埃希菌與其產(chǎn)ESBLs有相關(guān)性,從而表現(xiàn)出多重耐藥性.②aac(3)-Ⅱ基因在54株大腸埃希菌中檢出率為88.5﹪;重組菌BL2l(DE3)/pET26::aac(3)-Ⅱ?qū)c大霉素有耐藥性,而對(duì)其余爭(zhēng)5種氨基糖苷類抗生素沒(méi)有表現(xiàn)出耐藥性.③融合基因重組菌BL21(DE3)/pET28::aac(3)-Ⅱ/tem-116與aac(3)-Ⅱ基因重組菌均只對(duì)慶大霉素和卡那霉素耐藥;對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性中,融合基因重組菌與tem-

6、116基因重組菌的耐藥譜沒(méi)有差別,因此融合基因aac(3)-Ⅱ/tem-116表達(dá)的融合蛋白酶具有雙酶活性,并且與天然的單一基因酶相比,在活性上沒(méi)有差別.④通過(guò)易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)的方法,對(duì)aac(3)-Ⅱ基因進(jìn)行體外進(jìn)化,經(jīng)過(guò)兩次的易錯(cuò)PCR,獲得一突變株,其活性與原始野生株相此提高了4～5倍. 以上研究表明:(1)第一部分中,分析了大腸埃希菌對(duì)7種氨基糖苷類抗生素的耐藥性和菌株產(chǎn)ESBLs的相關(guān)情況,對(duì)于臨床上使用抗生素有一定的