大腸埃希菌質(zhì)粒AmpC酶和ESBLs的基因型及耐藥性研究.pdf

1、目的：大腸埃希菌是引起臨床感染尤其是醫(yī)院內(nèi)感染最常見的革蘭陰性桿菌之一。其對抗菌藥物的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，對三代頭孢菌素的耐藥主要是由于產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和質(zhì)粒AmpCβ-內(nèi)酰胺酶。當(dāng)一株細(xì)菌同時產(chǎn)這兩種酶時，預(yù)示著其具有更強(qiáng)的耐藥性。本課題選取天津地區(qū)兩家三級甲等醫(yī)院臨床分離的大腸埃希菌作為研究對象，分析其對常見抗菌藥物的耐藥性，研究質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶和ESBLs的流行情況及基因型分布，為正確掌握細(xì)菌耐藥的發(fā)展趨勢、

2、臨床合理應(yīng)用抗生素及延緩和控制耐藥基因的播散提供理論依據(jù)。 方法：選取2006年3月～12月天津市兩家三級甲等綜合醫(yī)院臨床分離的大腸埃希菌作為受試菌，依據(jù)醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)將其區(qū)分為醫(yī)院感染和社區(qū)感染菌；分別采用K-B法及微量肉湯稀釋法對所有菌株進(jìn)行藥敏試驗，并比較其對不同抗菌藥物的耐藥性；采用ESBLs初篩及紙片確認(rèn)試驗檢測產(chǎn)ESBLs菌株，并分析產(chǎn)酶菌與非產(chǎn)酶菌的耐藥情況；采用三維試驗檢測產(chǎn)AmpC酶菌株；對三維試驗陽性的菌株

3、，擴(kuò)增質(zhì)粒AmpC酶基因以確定其基因型；進(jìn)行質(zhì)粒接合試驗以定位耐藥酶基因，并采用K-B法對供體菌及接合子進(jìn)行藥敏試驗；對質(zhì)粒AmpC酶基因擴(kuò)增及質(zhì)粒接合試驗陽性同時合并ESBLs陽性的菌株，再進(jìn)行ESBL基因的PCR擴(kuò)增以確定其基因型；將部分同時產(chǎn)質(zhì)粒AmpC酶和ESBLs菌株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在GenBank上行同源性分析。 結(jié)果：1.自2006年3月～12月天津市兩家醫(yī)院共分離大腸埃希菌203株，其中醫(yī)院內(nèi)感染

4、菌株占19.7％。藥敏結(jié)果示：受試菌對亞胺培南最為敏感，耐藥率僅為0.5％；對頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢西丁及阿米卡星敏感性也較好，耐藥率在10％～20％之間；對頭孢唑啉、頭孢呋辛、哌拉西林、慶大霉素、氧氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率均高于60％。其中醫(yī)院感染菌的耐藥率明顯高于社區(qū)感染菌。2.ESBLs紙片確認(rèn)試驗陽性菌55株，檢出率為27.1％，其中醫(yī)院感染菌株的ESBLs陽性率為62.5％，明顯高于社區(qū)感染菌株

5、(P<0.05)。產(chǎn)ESBLs菌株對抗菌藥物的耐藥率高于非產(chǎn)ESBLs菌株；產(chǎn)ESBLs菌株對頭孢噻肟的耐藥率明顯高于頭孢他啶。AmpC酶三維試驗陽性菌12株，檢出率為5.9％，其中醫(yī)院感染菌株的AmpC酶表型檢測陽性率為10.0％，高于社區(qū)感染菌，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AmpC酶及ESBLs同時陽性者為7株，檢出率為3.4％。3.對12株AmpC酶三維試驗陽性菌株行質(zhì)粒AmpC酶基因的PCR擴(kuò)增，8株擴(kuò)增陽性，其中6株(

6、E59，E85，E134，E168，E184，E200)擴(kuò)增出CIT型462bp的目的片段，2株(E112，E220)擴(kuò)增出DHA型405bp的片段。對此8株菌進(jìn)行質(zhì)粒接合試驗，所有菌株均接合成功。藥敏結(jié)果示：供體菌幾乎對三代頭孢、慶大霉素及喹諾酮類藥物全部耐藥，對頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦及阿米卡星也顯示了不同程度的耐藥，僅對亞胺培南全部敏感；供體菌將對β-內(nèi)酰胺類的耐藥性成功傳遞給了受體菌，但藥敏結(jié)果顯示部分接合子對頭孢吡肟及頭孢哌

7、酮/舒巴坦的耐藥性與供體菌相比有所下降，且2株接合子出現(xiàn)了對氨基糖甙類的耐藥。4.在8株質(zhì)粒接合試驗陽性菌株中，3株同時合并ESBLs表型檢測陽性。對此3株菌進(jìn)行ESBLs基因的PCR擴(kuò)增：1株(E59)同時產(chǎn)TEM型和CTX-M-3組型目的片段，1株(E112)同時產(chǎn)TEM型和CTX-M-14組型目的片段，1株(E220)同時產(chǎn)TEM型、CTX-M-3組型和CTX-M-14組型目的片段。對部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，結(jié)果示：E59菌株

8、CIT型基因與CMY-2型AmpC酶100％同源；E220菌株DHA型基因與DHA-1型AmpC酶、TEM型基因與TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶、CTX-M-3組型基因與CTX-M-55型ESBLs、CTX-M-14組型基因與CTX-M-19型ESBLs100％同源。 結(jié)論：天津地區(qū)兩家醫(yī)院大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥性略高于2005年的國內(nèi)平均水平，其ESBLs和AmpC酶檢測陽性率均略低于國內(nèi)其它地區(qū)的報道。本研究首次報道了