安徽省部分醫(yī)院產(chǎn)質粒介導AmpC酶的肺炎克雷伯菌耐藥性及其基因型分布.pdf

1、目的：了解安徽省2005年臨床分離的247株肺炎克雷伯菌產(chǎn)質粒介導AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的情況及產(chǎn)酶菌株的耐藥性。研究產(chǎn)質粒介導AmpC β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株的耐藥基因型別的分布。研究AmpC β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株其他耐藥基因的分布。研究新酶的生化特性：等電點和酶對抗菌藥物的水解特性。 方法： 收集安徽省細菌耐藥監(jiān)控網(wǎng)中的25家市級醫(yī)院2005年9月(9月1日到30日)從臨床標本(去除同一病例相同部位重復分離的菌株)中分離

2、的肺炎克雷伯菌247株，采用全自動微生物分析儀對標本進行重新鑒定。經(jīng)頭孢西丁紙片法試驗篩選出產(chǎn)AmpC酶菌株，對初篩陽性的細菌，采用三維試驗篩選，質粒提取和多重聚合酶鏈反應(PCR)擴增攜帶AmpC酶菌株基因，并用瓊脂平板稀釋法測定其對12種抗菌藥物的耐藥性。 將多重PCR擴增篩選出的AmpC酶陽性的菌株行轉移接合試驗，對接合子進一步行全編碼引物PCR擴增，將全編碼區(qū)PCR擴增產(chǎn)物按Sanger雙脫氧末端終止法，用自動測序儀對其

3、進行測序以鑒定基因型。 以20株AmpC酶陽性的菌株總DNA為模板，使用blaCTX-M、blaSHV、blaTEM以及blaOXA組通用引物進行PCR擴增以篩選出ESBLs陽性菌株，分析AmpC β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株其他耐藥基因的分布。 同時對有基因突變的菌株進行克隆表達，提酶，進行等電點的測定和酶對抗菌藥物水解率的研究，并通過Southern雜交證明其確實位于質粒上。 結果： 247株肺炎克雷伯桿菌中

4、，采用K-B法初篩出對頭孢西丁中介或者耐藥的菌株49株，對49株初篩陽性的細菌采用三維試驗，質粒提取和多重PCR進一步篩選出產(chǎn)Ampc酶陽性菌20株，占40.8％(20/49)。據(jù)引物擴增片段大小(DHA為405bp，EBC為302bp，CIT為462bp)，判定其中DHA型14株，EBC型4株，CIT型2株。20株AmpC酶陽性菌對頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢西丁的耐藥率均在55％以上，對哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率為48.26％，對頭孢吡

5、肟的耐藥率為31.03％。 將多重PCR擴增篩選出的AmpC酶陽性的菌株行接合試驗，全編碼基因引物擴增，擴增產(chǎn)物測序后發(fā)現(xiàn)有11株攜帶的AmpC酶為DHA-1型，2株CIT型產(chǎn)物為CMY-2型，EBC型的產(chǎn)物中有3株為ACT-1型，另外1株有突變。突變株中K.preu462與AM076977.1(ACT-2型AmpC酶)比較存在6個核苷酸突變位點分別是102A→G，303C→G，688G→A，975G→A，990C→T，其中68

6、8位的突變引起氨基酸的改變，由纈氨酸→異亮氨酸，GenBank登錄號是EFl25013。 使用ESBLs通用引物擴增出CTX-M-1陽性菌株為1株，CTX-M-9陽性菌株為8株，SHV型2株，TEM型9株，OXA-1型1株。發(fā)現(xiàn)有1株攜帶3種以上耐藥基因。 對K.preu 462菌株克隆表達，提酶后，等電點測定為8.6，且酶對頭孢西丁有高水解率。對突變株行Southern雜交，證實其為質粒介導。 結論：

7、安徽省部分醫(yī)院的產(chǎn)質粒介導AmpC酶的菌株表現(xiàn)為多重耐藥，除亞胺培南、美羅培南、頭孢吡肟、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦外，對其余7種藥物的耐藥率>55％。產(chǎn)酶株較非產(chǎn)酶株對喹諾同類，頭孢吡肟以及含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復合制劑耐藥率為高，但對第三代頭孢菌素的耐藥率為低，可能是因為非產(chǎn)酶菌產(chǎn)ESBLs。目前認為可用于治療產(chǎn)AmpC酶細菌感染的有效抗菌藥物主要是碳青霉烯類和第四代頭孢菌素。在我省收集的247株腸桿科細菌中發(fā)現(xiàn)17株質粒介導的Am