肺炎克雷伯菌中若干β-內(nèi)酰胺酶基因分布及耐藥性的初步研究.pdf

1、目的：
　　本文主要研究了臨床上最為常見的重要致病菌肺炎克雷伯菌中β-內(nèi)酰胺酶基因的分布及耐藥性分析。采用新一代高通量測序技術(shù)分析240株肺炎克雷伯菌混合基因組中已知的β-內(nèi)酰胺酶基因的分布，隨后逐株篩選肺炎克雷伯菌中出現(xiàn)的blaKPC、 blaCARR、blaLEN及blaKLUC四種β-內(nèi)酰胺酶基因。blaKPC基因是碳青霉烯酶基因，能水解包含碳青霉烯類抗生素在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，是現(xiàn)階段肺炎克雷伯菌中主要研究的β

2、-內(nèi)酰胺酶耐藥基因之一;blaCARB基因和blaLEN基因在肺炎克雷伯菌中報(bào)道較少;blaKLUC基因只在陰溝腸桿菌和大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，還未在肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)。篩選出陽性菌株后通過克隆表達(dá)實(shí)驗(yàn)，藥敏實(shí)驗(yàn)、接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)和S1-PFGE實(shí)驗(yàn)，分析本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的β-內(nèi)酰胺酶基因的分子流行病學(xué)趨勢、耐藥性功能及定位。
　　方法：
　　1.用堿裂解法提取從溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離得到的240株肺炎克雷伯菌基因組DNA，等量混

3、合后，將混合基因組DNA使用第二代Illumina/solexa測序技術(shù)進(jìn)行高通量測序。
　　2.從Genbank、ARDB(Antibiotic resistance database)數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)中收集β-內(nèi)酰胺酶基因。
　　3.將測序所得到的短序列用一系列的生物信息學(xué)工具比對定位到收集到的β-內(nèi)酰胺酶基因的參照基因序列上，檢測出測序的肺炎克雷伯菌所包含的β-內(nèi)酰胺酶基因的類型及豐度。
　　4.根據(jù)篩查到的β-內(nèi)酰

4、胺酶基因，選取blaKPC、 blaCARB、blaLEN及blaKLUC基因，設(shè)計(jì)引物。以上述240株肺炎克雷伯菌每株菌的單獨(dú)基因組作為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶基因，分離出含有β-內(nèi)酰胺酶基因的陽性菌株。
　　5.通過瓊脂稀釋法檢測攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因的肺炎克雷伯菌原始菌株對臨床常用β-內(nèi)酰胺類抗生素的最低抑菌濃度(MIC)。
　　6.功能驗(yàn)證:擴(kuò)增帶有EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切位點(diǎn)的β-內(nèi)酰胺酶基因，與pET

5、-28(a)構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入E.coli BL21實(shí)現(xiàn)表達(dá)，驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)中篩選出來的肺炎克雷伯菌所攜帶的β-內(nèi)酰胺酶基因的耐藥性功能。
　　7.通過對攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因菌株的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)和對接合轉(zhuǎn)移成功菌株進(jìn)行S1-PFGE等實(shí)驗(yàn)來對本實(shí)驗(yàn)新發(fā)現(xiàn)的β-內(nèi)酰胺酶基因新基因型進(jìn)行初步的亞細(xì)胞定位。
　　結(jié)果：
　　1.從數(shù)據(jù)庫收集到75條β-內(nèi)酰胺酶基因。
　　2.solexa測序結(jié)果

6、和數(shù)據(jù)庫收集到的β-內(nèi)酰胺酶基因比對后，肺炎克雷伯菌中存在的β-內(nèi)酰胺酶基因有blaCARB、blaKPC、blaKLUC、blaLEN、blaNDM、blaOKP-A、blaZ、blaDHA、blaSHV、blaTME、blaCTX-M-9群、blaCTX-M-1群和blaOXY。
　　3.選取blaCARB、blaKPC、 blaKLUC及blaLEN這四個(gè)β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因設(shè)引物，通過PCR及測序。在240株肺炎克雷伯菌中

7、，篩選出攜帶blaKPC基因的9株，陽性檢出率為3.75％;攜帶blaLEN基因的4株，陽性檢出率為1.67％;攜帶blaCARB基因1株，陽性檢出率為0.42％;攜帶blaKLUC基因的1株檢出率為0.42％。其中有一株菌同時(shí)攜帶blaLEN、blaCARB和blaKLUC三個(gè)基因。
　　4.通過瓊脂稀釋法檢測攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因的肺炎克雷伯菌對不同β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物的敏感程度。結(jié)果顯示，攜帶blaK，C基因的9株肺炎克雷伯

8、菌和同時(shí)攜帶blaLEN、blaCARB和blaKLUC三個(gè)基因的菌株KP1276比只攜帶blaLEN基因的菌株明顯耐β-內(nèi)酰胺酶類抗生素藥物。而攜帶blaKPC基因的菌株又比同時(shí)攜帶blaLEN、blaCARB和blaKLUC三個(gè)基因的菌株以及只攜帶blaLEN基因的菌株更容易水解碳青霉烯類抗生素（亞胺培南和美羅培南）。
　　5.通過克隆表達(dá)實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建15株克隆菌:其中攜帶blaKLUC基因的1株，攜帶blaCARB基因的1株

9、，攜帶blaLEN基因的4株，攜帶blaKPC基因的9株。說明blaCARB、blaKPC、blaKLUC及blaLEN基因與細(xì)菌的多重耐藥性有關(guān)。
　　6.接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)得到了1株攜帶blaKLUC基因的接合子、3株攜帶blaKPC基因的接合子。通過檢測16srRNA確認(rèn)這四株菌均為大腸桿菌EC600。用瓊脂稀釋法對比接合子和原始菌以及受體菌E.coli EC600的藥物敏感程度。發(fā)現(xiàn)對β-內(nèi)酰胺類藥物氨芐西林、頭孢唑啉、哌拉西林

10、和頭孢吡肟，接合子比受體菌E.coli EC600高了5到9個(gè)耐藥梯度。
　　7.本次實(shí)驗(yàn)在肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了1株攜帶blaKLUC基因的菌株，這株菌還同時(shí)攜帶blaLEN基因和blaCARB基因。對這株菌進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)和接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)說明blaKLUC基因與細(xì)菌的多重耐藥性有關(guān)。對接合轉(zhuǎn)移成功菌株E.coliEC600-blaKLUC-KP1276做S1-PFGE，結(jié)果顯示KP1276成功轉(zhuǎn)移一個(gè)質(zhì)粒至EC600，可初步確定bla

11、KLUC存在于質(zhì)粒上。
　　結(jié)論：
　　1.肺炎克雷伯菌中稀有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的低陽性檢出率與高通量測序技術(shù)以及生物信息學(xué)技術(shù)得到的豐度圖結(jié)果較為一致，這使我們能夠在短時(shí)間內(nèi)利用大規(guī)模基因組測序，來探索基因結(jié)構(gòu)與病原菌耐藥性的關(guān)系，對于致病菌中耐藥基因的分布及新基因的發(fā)掘和功能研究起著極為有效的作用，為新藥的研制與開發(fā)提供了新的思路。
　　2.本次實(shí)驗(yàn)共篩選出9株攜帶blaKPC基因、4株攜帶blaLEN基因、1株

12、blaCRB基因和1株攜帶blaKLUC基因的肺炎克雷伯菌，其中有一株有菌同時(shí)攜帶blaLEN基因，blaCARB基因和blaKLUC基因。
　　3.成功構(gòu)建克隆表達(dá)載體并對其進(jìn)行藥敏檢測，確定發(fā)現(xiàn)的基因型確實(shí)是與細(xì)菌多重耐藥性有關(guān)的。
　　4.本次實(shí)驗(yàn)在肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了1株攜帶blaKLUC基因的菌株，這株菌還同時(shí)攜帶blaLEN基因和blaCARB基因。對這株菌進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)和接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)說明blaKLUC基因與細(xì)菌的