太原地區(qū)革蘭陰性桿菌產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的基因型及耐藥性研究.pdf

1、革蘭陰性桿細(xì)菌是導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染最為常見的病原菌。革蘭陰性細(xì)菌繼產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)后，又產(chǎn)生了新型的AmpCβ-內(nèi)酰胺酶(AmpC beta-lactamases，AmpC酶)，AmpC酶多數(shù)由染色體介導(dǎo)：但近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶，由于質(zhì)粒介導(dǎo)ampC耐藥基因可在同種或不同種屬細(xì)菌間廣泛播散，給臨床抗菌治療帶來困難，己引起廣泛重視。為了解太原地區(qū)部分醫(yī)院革蘭陰性桿菌耐藥與抗生素的使用情況以及它們之間的關(guān)

2、系、革蘭陰性桿菌高產(chǎn)AmpC酶的發(fā)生水平、質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的基因型分布、流行情況、產(chǎn)酶菌的耐藥性以及頭孢吡肟對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的接種效應(yīng)等進(jìn)行了本課題的研究。 材料與方法： 1、1998-2006年山醫(yī)二院抗生素使用情況及細(xì)菌耐藥性分析 資料來源：抗生素的消耗數(shù)據(jù)來自山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院1998：年1月至2006年12月9年的藥品出庫數(shù)量，按抗生素的化學(xué)名分別統(tǒng)計(jì)其規(guī)格、單價(jià)、DDD值

3、、銷售金額及用藥頻度DDDs，然后分類匯總。 試驗(yàn)用菌株：來源于同一醫(yī)院1998年1月至2006年12月的臨床分離菌株，標(biāo)本來源包括痰、分泌物、咽拭子、血液、尿液、胸腔積液、腹腔積液等。 分析方法： (1)采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的限定日劑量法分析各種抗菌藥的DDDs。各種藥物的DDD值據(jù)《中國藥典》2005年版二部及《新編藥物學(xué)》15版中成人常用日劑量，新藥采用藥品說明書推薦的常規(guī)劑量。DDDs=某抗菌藥年消耗量

4、/該藥的DDD值。 (2)用V1TEK2系統(tǒng)對(duì)臨床分離茵株進(jìn)行鑒定，采用K-B紙片擴(kuò)散法及VITEK2系統(tǒng)和GNI細(xì)菌鑒定卡對(duì)所分離的革蘭陰性桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，按2004年版CLSI/NCCL標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，用WHONET5.3軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 (3)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行耐藥率與用藥量的相關(guān)性分析，細(xì)菌耐藥率與抗生素使用頻度DDDs之間的關(guān)系，用偏相關(guān)分析方法分析。 2、革蘭陰性菌高產(chǎn)AmpC酶的檢測

5、 受試菌株：為2004年9月至2006年8月間，太原地區(qū)四家醫(yī)院感染對(duì)青霉素類、第一、二代及一種以上第三代頭孢菌素耐藥的無重復(fù)革蘭陰性菌株。 產(chǎn)AmpC酶菌株的初篩與確證試驗(yàn)：采用K—B法以頭孢西丁紙片檢測受試菌株，抑菌圈直徑≤ 17mm者為疑產(chǎn)AmpC酶株。對(duì)疑產(chǎn)株通過AmpC酶提取物做頭孢西丁三維試驗(yàn)檢測AmpC酶。同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和ESBI s菌株的檢測：對(duì)產(chǎn)AmpC酶菌株的酶提取物進(jìn)行頭孢曲松三維試驗(yàn)檢測ES

6、BLs。AmpC酶表型篩選：采用IPM，F(xiàn)EP，CD02，CD03，CTX五種紙片進(jìn)行篩選產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌。 3、革蘭陰性菌產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的基因型及耐藥性研究 受試菌株：2004年9月至2006年8月間，山西太原地區(qū)四家醫(yī)院內(nèi)感染無重復(fù)臨床分離菌株。采用VlTEK2鑒定系統(tǒng)和GNI細(xì)菌鑒定卡進(jìn)行鑒定。 質(zhì)粒DNA模板的制備：采用B型質(zhì)粒小樣抽提試劑盒提取三維實(shí)驗(yàn)AmpC酶陽性的臨床分離株細(xì)菌質(zhì)

7、粒。 引物設(shè)計(jì)：根據(jù)各亞型AmpC酶核昔酸序列的同源性，將其分為5組：DHA組、ACT組、FOX-1-6組、CMY-G1組、CMY-G2組，分別設(shè)計(jì)通用引物。將各亞型ESBLs核昔酸序列分為9組：TEM組、SHV組、CTX-M1組、CTX-M9組、 TeTA組、TeTB組、 gyrA組、 gyrB組、 PArC組，分別設(shè)計(jì)通用引物。 PCR擴(kuò)增ampC以及同產(chǎn)的ESBLs基因、產(chǎn)物分析與測序：ampC和ESBLs基因PC

8、R擴(kuò)增后，產(chǎn)物在含0.5u g/ml溴乙啶的1.2％瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相后切膠回收純化試劑盒純化后，送往測序公司測序，結(jié)果與GenBank提供的質(zhì)粒型AmpC酶和ESBLs基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)以確定其基因亞型。 質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：耐疊氮鈉的大腸埃希菌J53Azi<'R>為受體菌，以PCR電泳ampC基因陽性條帶菌株為供體菌。 4、產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶細(xì)菌的耐藥性及其分子流行病學(xué)研究 受

9、試菌株：臨床分離株為2004年9月至2006年8月間，太原地區(qū)四家醫(yī)院臨床分離產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶革蘭陰性菌株。 細(xì)菌染色體DNA的制備：采用煮沸法提取菌體DNA. 菌株DNA同源性分析：采用腸桿菌科基因組內(nèi)重復(fù)一致序列聚合酶鏈反應(yīng)(ERIC-PCR)進(jìn)行產(chǎn)酶菌克隆株的DNA分型。 PCR產(chǎn)物分析：采用1.5％瓊脂糖凝膠電泳。 DNA同源性判定標(biāo)準(zhǔn)：PCR擴(kuò)增條帶完全相同，為同一基因型；相差1條者為基因型

10、密切相關(guān)；相差2-3條者為基因型可能相關(guān)，不滿足上述條件者為不同的基因型。 重復(fù)性檢測：大腸埃希菌ATCC25922以及從80株臨床分離株中隨機(jī)抽取2株，在三天內(nèi)各培養(yǎng)18小時(shí)后，分別提取其菌體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 5、頭孢吡肟對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌的接種效應(yīng) 受試菌株：質(zhì)粒產(chǎn)AmpC酶的大腸埃希菌株。 受試藥物：頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦和亞胺培喃，將其配成濃

11、度依次為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μ g/ml。藥物敏感實(shí)驗(yàn)：用兩種不同的細(xì)菌濃度，即標(biāo)準(zhǔn)濃度5*10cfu/mL和高濃度5*10<'7>cfu/mL，分別測定其MIC值。 接種效應(yīng)陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：在5*10<'7>cfu/mL細(xì)菌接種濃度下測得的MIC值≥8倍的標(biāo)準(zhǔn)濃度下測得的MIC值，為有接種效應(yīng)。 結(jié)論： 1、革蘭陰性菌的耐藥率呈上升趨勢，抗生素使用頻度呈下降趨勢，銷售

12、金額呈上升趨勢，抗生素的使用檔次越來越高。 2、革蘭陰性菌特別是腸桿科細(xì)菌對(duì)亞胺培南仍保持非常好的敏感性，對(duì)喹諾酮類藥物耐藥性嚴(yán)重。 3、細(xì)菌對(duì)很多抗生素的耐藥率都與加酶抑制劑的使用有正相關(guān)。 4、醫(yī)院感染產(chǎn)AmpC酶革蘭陰性菌中，基本上約50％的比例單產(chǎn)AmpC酶，另約50％為同產(chǎn)AmpC酶和ESBLs酶細(xì)菌。 5、三維試驗(yàn)可作為一種實(shí)驗(yàn)室用來鑒別常見臨床分離革蘭陰性桿菌耐藥株是否產(chǎn)AmpC酶、ESBL

13、s和金屬酶的方法。表型篩選試驗(yàn)操作簡單、快速，可以作為臨床實(shí)驗(yàn)室初選AmpC酶的篩選方法。 6、太原地區(qū)分離到DHA-1、ACT-1及CMY-G2三種基因型的質(zhì)粒AmpC酶。銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)了CMY-G2基因，國內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道。 7、三種質(zhì)粒產(chǎn)AmpC酶的基因型均可通過質(zhì)粒接合傳遞實(shí)驗(yàn)將耐藥質(zhì)粒傳給受體菌。 8、同產(chǎn)ESBLs的基因型以CTX-M1為主，同時(shí)還有g(shù)yrA、gyrB及ParC型基因，PCR的TEM

14、型基因的陽性檢測結(jié)果，經(jīng)測序?yàn)榉荰EM型。 9、接合子保留了對(duì)頭霉素及大多數(shù)第三代頭孢菌素的耐藥性，對(duì)第四代頭孢菌素、加酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率有所下降，對(duì)碳青霉烯類藥物敏感。 10、對(duì)產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌感染，首選碳青霉素烯類如亞胺培南，第四代頭孢菌素如頭孢吡肟有一定療效。 11、產(chǎn)ACT-1、DHA-1及CMY-G2的革蘭陰性菌盡管存在多克隆，但是不同醫(yī)院間有很大的相似性。提示中小城市可能更容易造成攜