AHL-SdiA抑制大腸埃希菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的:
　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)移是細(xì)菌傳播耐藥基因的重要途徑。質(zhì)粒(plasmid)是的環(huán)形DNA，它不僅獨(dú)立于細(xì)菌染色體，而且能自主復(fù)制。部分質(zhì)粒具有轉(zhuǎn)移性，并能攜帶抗生素耐藥基因。廣泛宿主質(zhì)粒能穿梭于細(xì)菌間，因此質(zhì)粒被視為傳播耐藥的關(guān)鍵媒介。質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移的主要途徑是細(xì)菌的接合作用。接合作用(conjugation)是細(xì)菌借助性菌毛相互溝通、傳受DNA的過(guò)程。因此，細(xì)菌接合作用被視為傳播抗生素耐藥基因的重要途徑。AHL是細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的信

2、號(hào)分子。群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)是細(xì)菌感知群體數(shù)量變化，并調(diào)整群體行為的調(diào)控系統(tǒng)。其中，脂肪?；呓z氨酸內(nèi)酯(acylhomoserine lactones，AHL)是革蘭陰性菌QS系統(tǒng)的信號(hào)分子，它通過(guò)結(jié)合LuxR類(lèi)受體蛋白，實(shí)現(xiàn)調(diào)控基因表達(dá)。
　　蛋白SdiA是QS系統(tǒng)的受體蛋白，同時(shí)也是重要的轉(zhuǎn)錄因子。蛋白SdiA存在于大腸埃希菌中，能感知并結(jié)合其他細(xì)菌分泌的AHL。蛋白SdiA擁有DNA結(jié)合域，它能結(jié)

3、合基因的啟動(dòng)子，以調(diào)控基因表達(dá)。因此，QS系統(tǒng)通過(guò)AHL-SdiA調(diào)控基因表達(dá)。
　　一般認(rèn)為，質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的調(diào)控是由質(zhì)粒與宿主共同調(diào)控的過(guò)程，而受體菌參與接合調(diào)控則少有報(bào)道。本文推測(cè)，受體菌能通過(guò)QS系統(tǒng)調(diào)控質(zhì)粒轉(zhuǎn)移:受體菌分泌AHL，通過(guò)與宿主的蛋白SdiA結(jié)合，兩者形成復(fù)合物，以調(diào)控接合相關(guān)基因traⅠ。其中，蛋白TraⅠ能結(jié)合質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)oriT，參與質(zhì)粒的復(fù)制及轉(zhuǎn)移全過(guò)程，直接調(diào)控細(xì)菌接合作用。
　　因此，本文探究A

4、HL-SdiA與基因traⅠ的調(diào)控關(guān)系。另外，本文發(fā)現(xiàn)蛋白SdiA對(duì)sRNA的調(diào)控作用，展望后續(xù)研究AHL-SdiA-sRNA對(duì)細(xì)菌接合作用的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)采用大腸埃希菌SM10λπ作為質(zhì)粒供體菌。該菌染色體被整合了質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的調(diào)控元件(包含基因traⅠ)，并含有轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒pUC24T。質(zhì)粒pUC24T具慶大霉素(Gm)抗性，作為候選實(shí)驗(yàn)的篩選標(biāo)記。受體菌則選用銅綠假單胞菌PAO1。PAO1基因lasI、基

5、因rh1Ⅰ分別調(diào)控3-oxo-C12-HSL、C4-HSL的催化合成，后兩者為PAO1最主要的AHL。
　　實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)構(gòu)建接合模型、運(yùn)用熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)基因表達(dá)量以及啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒來(lái)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)假設(shè)。
　　構(gòu)建接合模型。分別將供、受體菌培養(yǎng)至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?MCF)。利用尿液分析儀測(cè)細(xì)菌濃度，并調(diào)配菌液濃度至1.0×107CFU/mL。供、受體菌各取100μ L，37℃混合培養(yǎng)6h。篩選合子并計(jì)數(shù)，換算接合頻

6、率。接合頻率高，則說(shuō)明接合作用則強(qiáng)。
　　qPCR檢測(cè)基因表達(dá)量。收集待測(cè)菌液，并抽提細(xì)菌全RNA組。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA作為模板，利用qPCR檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)量。
　　構(gòu)建基因traⅠ啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pQF50-PtraⅠ。以質(zhì)粒pQF50為載體，該質(zhì)粒缺少Laz啟動(dòng)子。運(yùn)用分子克隆技術(shù)，將基因traⅠ啟動(dòng)子及其上游317 bp片段，克隆于β-半乳糖苷酶基因上游。當(dāng)基因traⅠ啟動(dòng)子被激活時(shí)，其下游β-半

7、乳糖苷酶基因也被激活。后續(xù)通過(guò)β-半乳糖苷酶試驗(yàn)(ONPG試驗(yàn))檢測(cè)酶活性，便能反映出基因traⅠ啟動(dòng)子的表達(dá)狀況。酶活性高，則說(shuō)明基因traⅠ表達(dá)上調(diào)。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)觀察AHL-SdiA對(duì)基因traⅠ的調(diào)控情況。
　　結(jié)果:
　?、賁M10λπ-PAO1進(jìn)行接合反應(yīng)。敲除PAO1基因1asⅠ、基因rhlⅠ，即AHL的缺失能提高SM10λπ接合頻率(P＜0.001);若在此基礎(chǔ)上，加入3-oxo-C12-HSL、C4-HSL干預(yù)

8、接合反應(yīng)，接合頻率則降低（P＜0.05）。敲除SM10λπ的基因sdiA，能增加SM10λπ-PAO1接合頻率(P＜0.001)。該結(jié)果提示，AHL與蛋白SdiA共同抑制SM10λπ接合作用。
　　②SM10λπ-EC600進(jìn)行接合反應(yīng)。其中，受體菌EC600為大腸埃希菌，自身不合成AHL。加入AHL干預(yù)，接合作用受抑制，SM10λπ-EC600接合頻率降低(P＜0.001);而在敲除基因sdiA后，接合頻率又回復(fù)至原水平。但是，

9、在不加AHL干預(yù)時(shí)，在敲除基因sdiA后，SM10λπ-EC600的接合頻率相近。該結(jié)果說(shuō)明，AHL抑制接合作用依賴(lài)于基因sdiA的表達(dá)。至此，實(shí)驗(yàn)從表型上闡明了AHL-SdiA抑制質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。
　?、跾M10λπ-PAO1進(jìn)行接合反應(yīng)。敲除PAO1基因lasL基因rh1Ⅰ,即AHL的缺失能上調(diào)SM10λπ基因traⅠ表達(dá)（P＜0.05）。若在此基礎(chǔ)上，加入3-oxo-C12-HSL、C4-HSL干預(yù)接合反應(yīng)，SM10λπ基因tra

10、Ⅰ表達(dá)降低(P＜0.05)。敲除SM10λπ的基因sdiA，SM10λπ基因traⅠ表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。該結(jié)果從分子上闡明了AHL-SdiA抑制質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。
　　④將含有報(bào)告質(zhì)粒pQF50-PtraⅠ大腸埃希菌BW25113進(jìn)行ONPG試驗(yàn)。加入AHL干預(yù)培養(yǎng)后，其β-半乳糖苷酶活性降低(P＜0.05)。而敲除BW25113基因sdiA或不加入AHL干預(yù)培養(yǎng)時(shí)，則均不降低酶活性。該結(jié)果說(shuō)明，AHL-SdiA抑制基因traⅠ啟動(dòng)

11、子。
　?、荼緦?shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)并初步驗(yàn)證4條sRNA與基因sdiA調(diào)控成正相關(guān)性。敲除SM10λπ基因sdiA，能下調(diào)RnpB、SibA、SibB、EyeA等sRNA的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　實(shí)驗(yàn)通過(guò)SM10λπ-PAO1、SM10λπ-EC600接合模型，從表型上闡明AHL-SdiA抑制質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。而后，通過(guò)qPCR檢測(cè)基因traⅠ表達(dá)變化及pQF50-PtraⅠ啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)，從分子水平闡明了AHL-