亞抑菌濃度頭孢他啶抑制大腸埃希菌生物膜的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本項(xiàng)目擬實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌E.coliMG1655為研究對象，首先確定亞-MIC CAZ對E.coli生物膜形成、細(xì)菌黏附性及運(yùn)動能力的抑制作用;再通過同源重組的方法分別構(gòu)建PBPs缺失株，考察敲除株生物膜形成能力、細(xì)菌黏附性及運(yùn)動性的變化，明確E.coli中與生物膜形成相關(guān)的PBP。再在亞-MIC CAZ作用下，考察MG1655野生株及敲除株生物膜形成、黏附、運(yùn)動能力、鞭毛及其合成相關(guān)基因的表達(dá)受到的抑制作用的差異，綜合分

2、析PBPs在其抑制MG1655生物膜形成過程中的作用，明確亞-MIC CAZ抑制E.coli生物膜形成的機(jī)制，為生物膜等臨床耐藥感染提供新的思路與參考靶點(diǎn)。
　　方法：
　　第一部分 亞-MIC頭孢他啶對大腸埃希菌運(yùn)動性、黏附性及生物膜形成能力的影響
　　1.1 藥敏試驗(yàn)
　　采用倍比稀釋法測定CAZ對E.coli MG1655的MIC。
　　1.2 亞-MIC CAZ對E.coli MG1655生物膜形成

3、的劑量-效應(yīng)分析采用結(jié)晶紫染色法，以MG1655為研究對象，每孔加入100μl菌液和100μl CAZ溶液。實(shí)驗(yàn)共分為6組，分別是空白組、CAZ1/32MIC、1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC組，37℃培養(yǎng)24h后移除浮游菌和培養(yǎng)液，以PBS沖洗并晾干。1％結(jié)晶紫染色后用30％冰醋酸溶解著色的生物膜，通過酶標(biāo)儀590nm處測定吸光度。
　　1.3 亞-MIC CAZ對E.coli MG1655生長的影響

4、r>　　將MG1655于37℃孵育24h，每2h測定OD590nm，繪制生長曲線。實(shí)驗(yàn)分為空白組、CAZ1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC組。
　　1.4 1/4MIC CAZ對E.coli MG1655黏附性的影響
　　實(shí)驗(yàn)分為空白組及1/4MIC CAZ組，37℃培養(yǎng)6h，生理鹽水緩慢沖洗兩次以除去未黏附細(xì)菌，每孔用1ml生理鹽水充分吹打至黏附細(xì)菌完全脫落并溶解，采用菌落平板計(jì)數(shù)法測定肉眼可見菌落數(shù)。
　　第

5、二部分 亞-MIC頭孢他啶通過PBPs抑制大腸埃希菌生物膜形成的機(jī)制研究
　　2.1 E.coliMG1655 mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株的構(gòu)建
　　CAZ主要通過三種PBPs與E.coli結(jié)合，分別是PBP1a（mrcA基因編碼）、PBP1b（mrcB基因編碼）以及PBP3（ftsI基因編碼）。以質(zhì)粒pKD3為模板通過PCR分別構(gòu)建含有氯霉素(Chloramphenicol，Cam)抗性基因的打靶序列，并將其轉(zhuǎn)

6、化入MG1655/pKD46，Cam抗性平板篩選陽性克隆。利用pCP20質(zhì)粒將Cam抗性基因刪除，從而獲得MG1655 mrcA、mrcB、ftsI基因缺失菌株。
　　2.2 基因敲除對E.coli MG1655細(xì)菌生長、生物膜形成、細(xì)菌黏附性及運(yùn)動性的影響
　　2.2.1 mrcA、mrcB、ftsI基因敲除對MG1655細(xì)菌生長的影響
　　采用分光光度法檢測MG1655野生株及mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株

7、細(xì)菌生長情況:將菌株分別于24孔板中37℃培養(yǎng)24h，每2h檢測OD590nm并繪制生長曲線。
　　2.2.2 MG1655 mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株生物膜形成能力的變化
　　將MG1655野生株及mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株分別于96孔板中37℃孵育24h，采用結(jié)晶紫染色法分別于590nm處測定吸光度。
　　2.2.3 MG1655 mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株細(xì)菌黏附性的變化

8、>　　將MG1655野生株及mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株分別于96孔板中37℃孵育6h，采用菌落平板計(jì)數(shù)法測定四種菌株細(xì)菌黏附性的差異。
　　2.3 亞-MIC CAZ對E.coli MG1655野生株及敲除株生物膜形成能力、黏附性、運(yùn)動性、鞭毛及其相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　2.3.1 藥敏實(shí)驗(yàn)
　　采用倍比稀釋法測定CAZ對E.coli野生株及敲除株的MICs。
　　2.3.2 1/4MIC CAZ對M

9、G1655野生株及敲除株生長的影響
　　以E.coli MG1655野生株和mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株為研究對象，每種菌株分為對照組及1/4MIC CAZ組，于37℃培養(yǎng)24h，每間隔2h測定OD590nm，根據(jù)光密度繪制生長曲線。
　　2.3.3 1/4MIC CAZ對MG1655野生株及敲除株生物膜形成能力的影響
　　分別將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋100倍并轉(zhuǎn)入96孔板中，每孔200μ1，每種菌株實(shí)驗(yàn)分組均為

10、空白組及1/4MIC CAZ組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。
　　2.3.4 1/4MIC CAZ對MG1655野生株及敲除株細(xì)菌黏附性的影響。
　　每種菌株實(shí)驗(yàn)分為空白組及1/4MIC CAZ組，采用菌落平板計(jì)數(shù)法測定亞-MICCAZ對四種菌株黏附性的影響。
　　2.3.5 1/4MIC CAZ對MG1655野生株及敲除株運(yùn)動性的影響
　　每種菌株均分為2組，分別為空白組及1/4MIC CAZ組，用牙簽分別挑單菌落垂直沾

11、至泳動運(yùn)動培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24h后，觀察泳動運(yùn)動情況并測量運(yùn)動范圍。
　　2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)用于兩樣本均數(shù)比較，統(tǒng)計(jì)以SPSS13.0進(jìn)行。
　　結(jié)果：
　　第一部分 亞-MIC頭孢他啶對大腸埃希菌運(yùn)動性、黏附性及生物膜形成能力的影響
　　1.1 CAZ對E.coli MG1655的MIC為0.5μg/ml。
　　1.2 CAZ在1/8MIC～1/2MIC范圍內(nèi)呈劑量依賴性抑

12、制E.coli MG1655生物膜的形成，其中1/2MIC CAZ對生物膜的抑制作用最強(qiáng)(P＜0.01)。
　　1.3 1/2MIC CAZ會抑制MG1655的生長，后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究選取1/4MIC。
　　1.4 加入1/4MIC CAZ后，平板中的菌落數(shù)量較空白組顯著減少(P＜0.01)，說明亞-MIC CAZ能夠抑制E.coli細(xì)菌的黏附性。
　　1.5 在不含藥物的培養(yǎng)基上長出的菌落平均直徑顯著高于加藥組(P＜0.0

13、1)，結(jié)果說明亞-MIC CAZ能夠抑制E.coli細(xì)菌的運(yùn)動性。
　　第二部分 亞-MIC頭孢他啶通過PBPs抑制大腸埃希菌生物膜形成的機(jī)制研究
　　2.1 經(jīng)Cam抗性基因刪除以后，mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為486bp、611bp及555bp，從PCR產(chǎn)物長度判斷，三種基因敲除株已成功分別構(gòu)建。
　　2.2 基因敲除對E.coli細(xì)菌生長、生物膜形成、細(xì)菌黏附性及運(yùn)動性的影響<

14、br>　　2.2.1 MG1655野生株與基因敲除株細(xì)菌的生長曲線均沒有顯著差異，說明mrcA、mrcB、ftsI基因的缺失對MG1655的生長沒有影響。
　　2.2.2 mrcA及ftsI基因敲除株生物膜形成能力與野生株沒有顯著性差異，而mrcB基因敲除株較野生株生物膜形成能力顯著降低(P＜0.05)。
　　2.2.3 mrcA與ftsI基因敲除株細(xì)菌的黏附性與野生株沒有顯著差異，而mrcB基因敲除株細(xì)菌的黏附性較野生株顯

15、著降低(P＜0.05)。
　　2.2.4 僅MG1655 mrcB基因敲除株泳動運(yùn)動范圍直徑顯著低于MG1655野生株(P＜0.05)。
　　2.3 亞-MIC CAZ對MG1655野生株及敲除株細(xì)菌生長、生物膜形成、黏附性、運(yùn)動性及鞭毛的影響
　　2.3.1 測得的CAZ對E.coli MG1655野生株及mrcA基因敲除株的MIC均為0.5μg/ml，mrcB基因敲除株為0.125μg/ml，ftsI基因敲除株為1

16、μg/ml。
　　2.3.2 1/4MIC CAZ對MG1655野生株及敲除株的生長均沒有影響，因此選用1/4MIC進(jìn)行后續(xù)研究。
　　2.3.3 1/4MIC CAZ僅對mrcB基因的E.coli生物膜形成沒有顯著的抑制作用。
　　2.3.4 亞-MIC CAZ對mrcB基因缺失株黏附性的抑制作用較其他菌株均減弱。
　　2.3.5 mrcB基因缺失株的運(yùn)動性受到的抑制作用較其他菌株均減弱。
　　2.3.6

17、 E.coli mrcB基因敲除株的細(xì)菌周圍鞭毛較野生株顯著減少，與亞-MIC CAZ作用下細(xì)菌的表現(xiàn)一致。
　　2.3.7 E.coli mrcB基因敲除株鞭毛合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)較野生株顯著降低，與亞-MIC CAZ作用下細(xì)菌的表現(xiàn)一致。
　　結(jié)論：
　　1.亞-MIC頭孢他啶能夠抑制E.coli的運(yùn)動性、黏附性及生物膜的形成。
　　2.基因敲除結(jié)果證明，PBP1b缺失的E.coli鞭毛生成相關(guān)基因表達(dá)降低導(dǎo)致