整合子相關(guān)的革蘭陰性菌耐藥機(jī)制研究.pdf

1、研究背景: 整合子(Integron)是存在于細(xì)菌基因組或質(zhì)粒上的基因片段，具有位點(diǎn)特異性重組功能，且能夠識(shí)別并捕獲移動(dòng)性基因盒?；蚝惺钦献铀鶖y帶的基因片段，常攜帶各種基因賦予整合子某方面的表型，其中很多是耐藥基因。整合子本身不能轉(zhuǎn)移，但其攜帶的耐藥基因盒可以通過(guò)整合酶在特異位點(diǎn)的酶切反應(yīng)，在整合子間轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌基因組中。因此整合子在細(xì)菌獲得性耐藥機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。銅綠假單胞菌(Pseudomanos aeru

2、ginos，P.A)是醫(yī)院感染常見(jiàn)的條件致病菌，且對(duì)多種抗生素存在天然和獲得性多重耐藥，其耐藥機(jī)制復(fù)雜。碳青霉烯類(lèi)抗生素是治療難治性銅綠假單胞菌感染的有效選擇，但由于抗生素的不合理不規(guī)范使用，出現(xiàn)了很多耐碳青霉烯類(lèi)的銅綠假單胞菌。因此研究碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥機(jī)制對(duì)于臨床合理用藥具有很大的指導(dǎo)意義。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 研究Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合子在革蘭陰性菌中的分布，及其攜帶的耐藥基因盒。以銅綠假單胞菌為例，研究金屬酶、整合子及外膜

3、蛋白在多重耐藥革蘭陰性菌中所起的作用，并探索三者的相關(guān)性。為指導(dǎo)臨床抗生素使用提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果: 1.革蘭陰性菌中整合子的鑒定及其耐藥基因盒的種類(lèi) 收集中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院2006年9月到2007年6月，多重耐藥革蘭陰性菌183株。根據(jù)各型整合酶和整合子已知基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR初篩并分型整合子；PCR擴(kuò)增整合子可變區(qū)，限制性片段多態(tài)性分析(RFLP)鑒定整合子可變區(qū)的同一性；PCR產(chǎn)物測(cè)序分析

4、整合子所攜帶的基因盒種類(lèi)。 結(jié)果：Ⅰ型整合子的陽(yáng)性率為54.6％(100/183)。發(fā)現(xiàn)四種整合子結(jié)構(gòu)，分別是blaVIM-2-aacA-Ib-aadA2-qacE，dfrh12-aadA2-aacE-blaCTX-M-2，dhfrX Ⅱ-orfF-aadA2，dhfrX Ⅱ-orfF-aadA2-sull。分別攜帶編碼碳青酶烯類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)及磺胺類(lèi)耐藥基因。無(wú)Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合子檢出。 2.耐碳青酶烯銅綠假單胞

5、菌的耐藥機(jī)制分析 選取42株銅綠假單胞菌，用EDTA協(xié)同實(shí)驗(yàn)分析各菌株所產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)；PCR擴(kuò)增其整合酶和整合子基因，測(cè)序確定其耐藥基因盒；RT-PCR半定量測(cè)定外排泵結(jié)構(gòu)基因mexA的表達(dá)水平；Western Blot測(cè)定外排泵結(jié)構(gòu)蛋白MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN的表達(dá)水平，以分析銅綠假單胞菌的耐碳青霉烯類(lèi)抗生素的機(jī)制，及各機(jī)制之間的相關(guān)性。 結(jié)果：產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶