多重耐藥革蘭陰性菌基因診斷與醫(yī)院感染的臨床、分子流行病學研究.pdf

1、醫(yī)院感染中革蘭陰性菌約占60％～70％，是引起人類感染性疾病的主要病原之一。近年來全球各地細菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，革蘭陰性菌對臨床常用抗菌藥物耐藥性日益嚴重，耐碳青霉烯類藥物的腸桿菌科細菌、非發(fā)酵菌比例逐年升高，且對其他臨床常用抗菌藥物也呈現(xiàn)多重耐藥，但是針對這部分“超級細菌”的抗菌藥物研發(fā)明顯落后，它所導致的感染治療困難，病死率高，已成為醫(yī)學界和公眾都非常關(guān)注和擔憂的問題。
　　常規(guī)病原學診斷方法包括細菌培養(yǎng)、分離及藥敏試驗，所需

2、時間長，難以及時指導感染性疾病的病原治療。隨著分子生物學與細菌基因組學的發(fā)展，快速、靈敏的核酸檢測方法已開始用于病原學的快速診斷及某些耐藥基因的檢測。本課題在分析臨床常見病原菌共有的23S rRNA基因及革蘭陰性菌主要耐藥基因的基礎(chǔ)上，探索建立可用于檢測多重耐藥革蘭陰性菌的快速基因診斷方法，并應用于臨床，有望為耐藥菌早期病原診斷、耐藥性分析提供客觀依據(jù)，從而及時、正確指導臨床抗感染治療方案的選擇。
　　預防重于治療，醫(yī)院感染中絕大

3、部分患者系經(jīng)過直接或間接接觸感染，屬于可控、可防的環(huán)節(jié)，切斷傳播途徑有望減少醫(yī)院感染的發(fā)病。因此對多重耐藥革蘭陰性菌導致的醫(yī)院感染進行流行病學及臨床研究可為控制耐藥菌傳播提供依據(jù)。本課題回顧性分析2005～2011年華山醫(yī)院共6年期間血流感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的臨床資料，總結(jié)院內(nèi)不動桿菌感染的臨床特點、菌株敏感性與預后關(guān)系。同時對2011年3月～2012年2月華山醫(yī)院血液、腦脊液標本分離的革蘭陰性菌進行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、碳青霉烯酶

4、、甲基化酶篩查以明確上述耐藥基因的流行情況。
　　本課題共包括以下三個部分:
　　第一部分 多重耐藥革蘭陰性菌基因診斷方法的建立
　　基因芯片技術(shù)是近幾年來快速發(fā)展的分子生物學技術(shù)平臺，因其具有快速、靈敏、特異、高通量、樣本用量少等特點而被廣泛應用于生物學研究的各個領(lǐng)域，在細菌菌種鑒定、耐藥基因檢測、基因突變及多態(tài)性、基因表達譜分析等方面均有不少探索性研究，但能否應用于臨床常規(guī)檢測仍有不少爭議?；诩毦颂求w核糖核酸(

5、rRNA)基因序列中保守區(qū)和多變區(qū)相互間隔排列的特點，利用基因序列保守區(qū)設計通用引物，利用多變區(qū)設計特異性探針，使基因芯片快速鑒定細菌菌種成為可能。國內(nèi)外先后有應用16S rRNA和23S rRNA基因檢測細菌的報道，但對于菌株的耐藥性無法得到明確的結(jié)果，難以正確指導臨床抗菌藥物的選擇。目前臨床上多重耐藥革蘭陰性菌中對健康威脅最大的產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，此外甲基化酶可導致菌株對氨基糖苷類高度耐藥，給治療帶來極大困難。本課題在前期利用23S

6、rRNA基因快速鑒定菌種的研究基礎(chǔ)上，設計了KPC、NDM、VIM、IMP型及OXA23、OXA51、OXA58組碳青霉烯酶耐藥基因、armA和rmtB型甲基化酶耐藥基因的PCR引物和探針，將耐藥性檢測的多對引物整合于1個PCR反應中，然后將所有探針固定于同一張基因芯片上，通過PCR產(chǎn)物與基因芯片雜交，可一次性明確菌株產(chǎn)常見碳青霉烯酶、甲基化酶情況，期望建立起能同步完成病原及耐藥譜檢測的基因診斷方法。結(jié)果證實基因芯片用于檢測NDM、IM

7、P、KPC、OXA23、OXA51、OXA58型碳青霉烯酶耐藥基因，armA型甲基化酶耐藥基因雜交信號滿意，可重復性好。但檢測VIM型碳青霉烯酶和rmtB型甲基化酶耐藥基因雜交信號不明顯，重復性差，仍需進一步優(yōu)化探針設計。
　　第二部分 多重耐藥革蘭陰性菌基因診斷方法的臨床研究
　　血流感染是臨床常見的重癥感染性疾病之一，具有較高的發(fā)病率及病死率，近年來發(fā)病率有上升趨勢。由耐藥菌導致感染的患者預后與能否及早針對病原選用敏感抗

8、菌藥物治療密切相關(guān)。為進一步評估基因芯片檢測多重耐藥革蘭陰性菌耐藥基因攜帶情況的診斷價值，本課題收集了2011年3月～2012年2月華山醫(yī)院血培養(yǎng)機器報陽標本356份，對其中119株革蘭陰性菌采用基因芯片進行碳青霉烯酶和甲基化酶耐藥基因檢測，結(jié)果與PCR方法進行比較。結(jié)果顯示基因芯片方法檢測KPC型、NDM型碳青霉烯酶耐藥基因、armA型甲基化酶耐藥基因與PCR方法的符合率為100％，檢測OXA23型、OXA51型碳青霉烯酶耐藥基因和r

9、mtB型甲基化酶耐藥基因與PCR方法的符合率分別為90.0％、80.0％和58.3％。基因芯片診斷方法所需時間約6～8小時，較常規(guī)紙片法藥敏試驗在鑒定時間上縮短16～18小時，若同步進行菌種鑒定及耐藥基因檢測，則較常規(guī)細菌培養(yǎng)+藥敏試驗縮短2天以上，有助于指導臨床血流感染抗菌藥物方案的選擇。
　　第三部分 多重耐藥革蘭陰性菌醫(yī)院感染的臨床及分子流行病學研究
　　腸桿菌科細菌和不動桿菌屬是多重耐藥革蘭陰性菌醫(yī)院感染的重要病原菌

10、。本課題收集華山醫(yī)院2005年1月～2011年12月共6年期間74例不動桿菌血流感染、90例中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的臨床資料進行回顧性分析，明確不動桿菌血流感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的臨床特征、抗菌治療與預后關(guān)系。結(jié)果表明不動桿菌血流感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染幾乎全為醫(yī)院感染，多發(fā)生于術(shù)后及重癥患者。不動桿菌對頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環(huán)素耐藥率較低，患者預后與不動桿菌對抗菌藥物的敏感性密切相關(guān)。此外為了解臨床分離革蘭陰性菌中常見耐藥基因攜帶情況，本

11、課題對2011年3月～2012年2月華山醫(yī)院自血液、腦脊液分離獲得的170株革蘭陰性菌應用PCR方法進行KPC、NDM、VIM、IMP、GIM、SPM、OXA23、OXA24、OXA58型碳青霉烯酶耐藥基因，SHV、TEM、CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因和armA、rmtB型甲基化酶耐藥基因檢測。結(jié)果顯示:58株紙片法對碳青霉烯類抗菌藥物不敏感革蘭陰性菌中有77.6％(45/58)菌株攜帶碳青霉烯酶耐藥基因。產(chǎn)KPC、OXA型碳

12、青霉烯酶是肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制。86株細菌紙片法對氨基糖苷類藥物不敏感菌株中有38.4％(33/86)菌株攜帶甲基化酶耐藥基因，甲基化酶耐藥基因也主要存在與肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌中。所有170株革蘭陰性菌中PCR檢測到產(chǎn)SHV菌株26株、產(chǎn)TEM菌株24株、產(chǎn)CTX-M菌株69株，在分離前三位革蘭陰性菌中大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs比例最高，為75.0％(27/36)。ERIC-PCR分析菌株同源性