整合子和16S rRNA甲基化酶介導(dǎo)的多重耐藥不動(dòng)桿菌機(jī)制研究.pdf

1、隨著抗生素的大量使用，近年來(lái)革蘭陰性桿菌在臨床分離率和耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，其中最主要為不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌和銅綠假單胞菌。不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌為條件致病菌，廣泛分布于水、土壤、醫(yī)院環(huán)境和人體皮膚表面。不動(dòng)桿菌屬中以鮑曼不動(dòng)桿菌最為常見(jiàn)，目前已成為繼大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌之后的重要臨床分離菌。多重耐藥不動(dòng)桿菌已經(jīng)在世界各地出現(xiàn)，甚至暴發(fā)流行。因此，加強(qiáng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)，研究多重耐藥分子機(jī)制是必須的。 本論文篩選出2007年8月

2、到2008年5月多重耐藥不動(dòng)桿菌并進(jìn)行流行病學(xué)研究。通過(guò)研究多重耐藥不動(dòng)桿菌中整合酶、整合子可變區(qū)基因，來(lái)分析整合子結(jié)構(gòu)確定整合子在不動(dòng)桿菌多重耐藥中的作用。最后通過(guò)16S rRNA甲基化酶基因的擴(kuò)增分析我院多重耐藥不動(dòng)桿菌對(duì)所有氨基糖苷類高水平耐藥的原因。 一、多重耐藥不動(dòng)桿菌的耐藥性及菌株同源性研究 利用K—B紙片擴(kuò)散法從我院2007年7月-2008年5月臨床分離的不動(dòng)桿菌中篩選出61株多重耐藥菌株，同時(shí)對(duì)三種不同類

3、抗生素耐藥的為多重耐藥菌株。 PCR擴(kuò)增OXA-51—like和16S rRNA-23S rRNA基因并且進(jìn)行基因序列分析將細(xì)菌鑒定到種。結(jié)果顯示61株多重耐藥不動(dòng)桿菌中有55株鮑曼不動(dòng)桿菌，3株3TU不動(dòng)桿菌，1株13TU不動(dòng)桿菌，1株醋酸鈣不動(dòng)桿菌，1株溶血不動(dòng)桿菌。 瓊脂稀釋法測(cè)定14種臨床常用抗菌藥物對(duì)多重耐藥不動(dòng)桿菌的耐藥表型。MIC結(jié)果顯示多重耐藥不動(dòng)桿菌對(duì)多粘菌素E耐藥率最低為9.7％，頭孢哌酮/舒巴坦耐

4、藥率為32.3％，米諾環(huán)素耐藥率16.1％，亞胺培南耐藥率為45.2％，對(duì)所有氨基糖苷類抗生素耐藥率高達(dá)90.0％以上。 脈沖場(chǎng)凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行同源性分析。條帶分析發(fā)現(xiàn)這61株菌株分為5個(gè)克隆，其中A、B為主要克隆株，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在我院已經(jīng)出現(xiàn)大范圍傳播，需采取有效措施進(jìn)行干預(yù)。 二、不動(dòng)桿菌整合子的結(jié)構(gòu)分析與耐藥相關(guān)性研究 設(shè)計(jì)整合酶基因特異性引物對(duì)61株多重耐藥不動(dòng)桿菌中整合酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；利用

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析整合子陽(yáng)性菌株與整合子陰性菌株對(duì)各臨床常用抗生素耐藥率之間的差異；以整合子陽(yáng)性菌株為研究對(duì)象，用PCR擴(kuò)增和步移法測(cè)序測(cè)定整合子可變區(qū)基因盒，通過(guò)序列比對(duì)分析了解內(nèi)插耐藥基因盒的情況，分析整合子結(jié)構(gòu)。 結(jié)果顯示61株多重耐藥菌株中50株1類整合酶陽(yáng)性(陽(yáng)性率82％)，未檢測(cè)出2、3類整合酶；對(duì)1類整合子陽(yáng)性和陰性菌株不動(dòng)桿菌耐藥率分析發(fā)現(xiàn)，整合子陽(yáng)性菌株對(duì)氨基糖苷類和喹諾酮類的耐藥率明顯高于整合子陰性菌株，(P＜0

6、.05)。對(duì)50株整合酶陽(yáng)性菌株進(jìn)行可變區(qū)基因擴(kuò)增，27株出現(xiàn)1000-4000bp大小不等的片段，其中13株菌株攜帶aacA4、catB8、aadA1基因，9株菌株攜帶aacC1、ortX、orfX'、aadA1基因，4株菌株攜帶arr-3、aadA4基因，1株菌株攜帶dfrA12、orfF、aadA2基因，主要介導(dǎo)氨基糖苷類、氯霉素、利福平、磺胺的耐藥。 三、介導(dǎo)氨基糖苷類高水平耐藥的16S rRNA甲基化酶的研究