不同試劑轉(zhuǎn)染RIP140-siRNA至庫普弗細(xì)胞效率及毒性的比較.pdf

1、目的：
　　以三種轉(zhuǎn)染試劑將RIP140-siRNA轉(zhuǎn)染至肝臟庫普弗細(xì)胞，通過不同的轉(zhuǎn)染效率以及試劑的細(xì)胞毒性和RIP140-siRNA對庫普弗細(xì)胞免疫活性之間的比較,探尋庫普弗細(xì)胞si-RNA的最佳轉(zhuǎn)染方式和條件。
　　方法:
　　本實驗研究采用lipofectamine2000，羅氏試劑（X-treme GENE siRNA Transfection Reagent）及嘌呤霉素篩選的慢病毒（1.0×108TU/ml

2、）作為轉(zhuǎn)染試劑，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果，ELISA檢測不同試劑轉(zhuǎn)染后庫普弗細(xì)胞NF-κb，IL-2，IL-10，TNF-α的分泌情況，分析其免疫活性的變化，激光掃描共聚焦顯微鏡分析不同試劑轉(zhuǎn)染后細(xì)胞RIP140的表達(dá)，通過流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析試劑轉(zhuǎn)染后庫普弗細(xì)胞的凋亡情況，以CCK-8試劑盒檢測三種轉(zhuǎn)染試劑對庫普弗細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。對正常組庫普弗細(xì)胞及三種試劑轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進行RT-RCR和Western blot檢測，分析

3、庫普弗細(xì)胞的RIP1140基因和蛋白質(zhì)表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　以轉(zhuǎn)染效率而言：慢病毒的轉(zhuǎn)染效率最高，可達(dá)80％以上；羅氏試劑其次；lipofectamine2000效果最差。在試劑的細(xì)胞毒性方面：流式細(xì)胞術(shù)分析羅氏試劑組細(xì)胞凋亡程度最低，以及CCK-8試劑盒結(jié)果顯示羅氏試劑對庫普弗細(xì)胞的毒性最小；慢病毒其次；lipofectamine2000的細(xì)胞毒性最大。ELISA結(jié)果顯示3種試劑轉(zhuǎn)染庫普弗細(xì)胞后，慢病毒細(xì)胞組（P<0

4、.05）免疫活性變化最大，NF-κb，IL-2，IL-10，TNF-α的分泌在轉(zhuǎn)染高峰后出現(xiàn)不同程度的增多或減少，其他兩組差異不明顯（P>0.05）。根據(jù)RT-RCR和Western blot結(jié)果得出慢病毒轉(zhuǎn)染RIP140-siRNA效果最好，庫普弗細(xì)胞RIP140呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，而lipofectamine2000和羅氏試劑組明顯高于慢病毒組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　在肝臟庫普弗細(xì)胞的RIP140-siRNA轉(zhuǎn)染