pegfp-n1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞的分布及效率

1、l l 2p E G F P ． N 1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞 的分布及效率 馮紅 ， 徐 文琳 ， 戰(zhàn) 銳 ， 錢(qián)令 嘉 ( 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所 ， 天津 3 0 0 0 5 0 )摘要 目的 ： 研 究 p E G F P — N 1 質(zhì)粒 蟹染心肌 細(xì)胞的分布及效 率。方法 ： 培 養(yǎng)乳 鼠心肌 細(xì)胞 ， 根 據(jù)乳 鼠心肌 細(xì)胞 的不 同生長(zhǎng) 時(shí)間( 1 ～3d ) 進(jìn)行 p E GF P — Nl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞

2、 的 實(shí)驗(yàn)研 究。結(jié)果 ：乳鼠心肌 細(xì)胞 生長(zhǎng) ld時(shí) ， p E G F P —N1 質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染心肌細(xì)胞 的效 率顯著 高于乳 鼠心肌 細(xì)胞生 長(zhǎng) 2d 、 3d時(shí)； p E GF P - N1質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染心肌細(xì)胞后 E G F P均 勻地充滿胞漿和胞核。結(jié)論 ： p E G F P — N 1 質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染乳 鼠心肌 細(xì)胞的效率與心肌細(xì)胞 的生長(zhǎng)期有 關(guān)； E G F P在心肌 細(xì)胞 中均 勻分布于胞漿和胞核。關(guān)鍵詞 ： p E G F

3、 PN1 質(zhì) 粒；轉(zhuǎn) 染；心肌細(xì)胞 ；分布；轉(zhuǎn) 染效率 中圖分類(lèi)號(hào) ： R 3 3 8 ． 2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ： A文章編 號(hào) ： 1 0 0 0 — 6 8 3 4 ( 2 0 0 5 ) O l — O l l 2 ～ 0 3綠色熒光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ， G F P ) 是 一 種來(lái) 自水母體 內(nèi)的生物發(fā)光物質(zhì) ， E G F P( e n h a n c

4、 e dg r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ) 是 G F P的突變體 ， 其熒光強(qiáng) 度是前者的 1 0 0 倍。與其他熒光標(biāo)記物相比， G F P的 一 個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)在于 G F P與蛋白偶聯(lián)后可在活細(xì)胞或 生物體 內(nèi)動(dòng)態(tài) 觀察 目標(biāo) 蛋 白質(zhì) 的表達(dá)、 分 布及 效 應(yīng) 。有關(guān) G F P 轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞效率及分布的研究 尚少見(jiàn)報(bào)道 ， 我 們成功培養(yǎng) 了乳 鼠心肌細(xì)胞 ， 觀察

5、了p E G F P - N 1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后 E G F P的分布情況，并按其生長(zhǎng)期進(jìn)行了 p E G F P - N 1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞 效率的研究 ， 從而為研究 目 標(biāo)蛋白質(zhì)在心肌細(xì)胞 中的定位建立了良好的技術(shù)平臺(tái)。1 材料與方法 1 ． 1 動(dòng) 物和 儀器 出生 1 ～3dWi s t a r 大 鼠( 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生 學(xué)環(huán)境 醫(yī)學(xué)研究所二級(jí)動(dòng)物房供應(yīng) ) 、 O l y m p u sI X7 0熒光倒置顯微鏡

6、、 N A P C OC O 2 培養(yǎng)箱 、 G H 8 0 2 — 2 型 超凈 臺(tái)、 U ． 2 0 0 1 紫外分光光度計(jì)。1 、 2 試 劑胰酶 、 ME M 為 G I B C O B R L公 司生產(chǎn) ； 胎 牛血 清購(gòu) 自中國(guó)醫(yī)學(xué)科 學(xué)院血液研究 所 ； L i p o f e c t a m i n e脂質(zhì)體 由 I n v i t r o g e n公 司生產(chǎn) ； p E G F P — N 1質(zhì)粒 由楊志華副研究員惠

7、贈(zèng)。1 ． 3 心 肌細(xì) 胞培 養(yǎng) 心肌細(xì)胞培養(yǎng)參照 S i m p s o n 方法【] 加 以改進(jìn) ，將出生 1 ～3dWi s t a r大鼠酒精消毒 ， 開(kāi)胸取心臟 ，剪碎后胰酶消化， 分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞 ， 用含 2 0 ％胎 牛 血 清 、 0 ． 1m m o l ／ LB r d u 、 1 ×1 0U ／ L青 霉 素 和1 0 0m g ／ L鏈霉素的 ME M 培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液 ，加入培 養(yǎng)瓶中 ， 置

8、于 3 7 ℃ 、 5 ％ C O ， 條件 下 的 C O ，培養(yǎng)箱 中， 1h 后吸出尚未貼壁的細(xì)胞懸液 ， 以 1 ． 0- 4 ． 0 ×1 0／ ml 接種 于六孔板 中， 置 于 c o e 培養(yǎng)箱 中培養(yǎng) 。1 ． 4 轉(zhuǎn)染用 p E G F P ． N 1 質(zhì)粒的純化 在 p E G F P — N 1 質(zhì)粒中加入 1 ／ 1 0體積的 3t o o l ／LN a A c ( p H5 ． 2 ) ， 2 ．

9、 5 倍體 積的無(wú)水 乙醇 ， 混 勻，一 8 0 ℃放置 1h ， 沉淀 D N A； 接著進(jìn)行無(wú)菌操作 ： 4 ℃1 20 0 0r ／ m i n 離心 1 0m i n ， 棄上清 ， 用 7 0 ％無(wú)水乙醇 重復(fù)洗兩次， 風(fēng)干后 ， 加入無(wú)菌水溶解。1 ． 5 轉(zhuǎn)染用 p E G F P ． N 1 質(zhì)粒的定量 用紫外分光 光度計(jì) 確定 p E G F P — N 1質(zhì) 粒的濃 度 。測(cè)定 O D 2 6 0 的值 ， 按公

10、式 p E G F P — N 1質(zhì)粒 的濃 度 ： O D 2 6 0× 5 0×稀 釋 倍 數(shù) 計(jì) 算 。本 研 究 中p E G F PN 1 質(zhì)粒 的濃 度 為 0 ． 4 9 1 1 g ／ t A 。1 ． 6p E G F P ． N 1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞 取 p E G F P — N 1 質(zhì)粒 1g 加入 1 ． 5m lE p 管 中，加入 1 0 0 ~ 1 無(wú)血清 ME M 培養(yǎng)基 ， 此管為

11、 1 號(hào)管 ； 另取一 1 ． 5m lE p管加入 1 0 01 無(wú)血 清 ME M 培養(yǎng) 基， 慢慢加入 6lL i p o f e c t a m i n e 脂質(zhì)體 ， 輕輕混勻 ，此管為 2號(hào)管 ； 將 1 號(hào) 管中的混合物慢慢加入到 2號(hào)管中， 室溫靜置 3 0 ～4 5mi n ； 用無(wú)血清 ME M 培養(yǎng) 基洗心肌細(xì)胞( 生長(zhǎng) 1 ～3d ) 兩次 ； 將兩管的混合物 慢慢 加 入到六 孔板 中 ， 補(bǔ)加 無(wú)血 清 ME

12、 M 培 養(yǎng) 基0 、 8m 1 ， 3 7 ℃培養(yǎng) 6 ～8h ； 然后 補(bǔ)加 含 2 0 ％胎牛血清的 培養(yǎng)液 1m l ， 繼續(xù)培養(yǎng) 4 0h 。1 ． 7p E G F P ． N 1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后在 心肌細(xì)胞 分布的觀察將轉(zhuǎn)染 心肌細(xì) 胞放在 激發(fā) 波長(zhǎng) 為 4 8 8n m 的 * 基金項(xiàng) 目： 國(guó)家 自 然科學(xué)基金資助項(xiàng) 目( 3 0 3 7 0 5 8 6 )收稿 日期 ： 2 0 0 40 7 — 0 6 ； 修

13、 回日期 ： 2 0 0 4 — 0 9 — 2 9作者簡(jiǎn)介 ： 馮 紅 ( 1 9 7 1) ， 女 ， 天津 人， 講 師， 博士在讀 ， 從事 應(yīng)激對(duì)心血管損傷機(jī)制方面的研究 。通 訊作者 維普資訊 http://www.cqvip.com 1 1 4Ch i nJAp p lP h y s i o l2 0 0 5 ； 2 1 ( 1 )DI S TRI BUTI oN AND EFF I CI ENCY OFp EGFP

14、- N1PLAS M I D AF TER I TSTRANS F ECTI oN I N CARDI oM YoCYTESF E NGHo n g ，X I U We n — l i n， Z HANRu i ，QI A N L i n g — j i a( I n s t i t u t eo fHe a l t ha n dE n v i r o me n t a lMe d i c i n e ，A c a d e m

15、yo fMi l i t a r yMe d i c a lS c i e n c e s ，Ti a n j i n3 0 0 0 5 0， C h i n a )AB S TRAC T Ai m ：Tos t u d yt h ed i s t r i b u t i o na n de f f i c i e n c yo fp EGF P — N1p l a s mi da f t e ri t st r a n s f e c

16、 t i o ni nc a r d i o m y o c y t e s ． M e t h o d s ：Th en e o n a t a lr a tc a r d i o my o c y t e swe r ec u l t u r e d ．Ac c o r d i n gt Ot h ed i f f e r e n tg r o w p e r i o do fn e o n a t a lr a tc a r d

17、 i o my o c y t e s ，t h ed i s t r i b u t i o na n de f f i c i e n c yo fp E GFP — N1p l a s mi da f t e ri t st r a n s f e c t i o ni nc a r d i o my o c y t e swe r es t u d i e d．Re s u l t s ：Th ee f f i c i e n

18、c ywa ss i g n i f i c a n t l yi n —c r e a s e da f t e rp EGF P — N1p l a s m i dt r a n s f e c t i o ni no n e — d a yc a r d i o my o c y t e s ．Th ed i s t r i b u t i o no fEGF Pwa si nt h ec y t o p l a s m a n

19、 dn u c l e u s ．Co n c l u s i o n：Th ee f f i c i e n c yo fp EGF P — N Ip l a s mi da f t e ri t st r a n s f e c t i o ni nc a r d i o my o c y t e swa sr e l a t e dt ot h eg r o w p e r i o d o fn e on a t a lr

20、a tc a r d i o m y o c y t e s ．Th ed i s t r i b u t i o no fEGF Pwa si nt h ec y t o p l a s m a n dn u c l e u s ．KE YW ORD S ： p E GF P — N1p l a s m i d ； t r a n s f e c t i o n ； c a r d i o my o c y t e ； d i s

21、t r i b u t i o n ； t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y傳入 神經(jīng) 阻滯對(duì)成 年大 鼠嗅球 中小 白蛋 白的 影響 秦 照萍， 葉樹(shù)明， 杜繼曾， 沈公羽( 浙 江大學(xué)生命科學(xué) 院玉泉校 區(qū)生物 系 ， 浙 江 杭 州 3 1 0 0 2 7 )摘要 目的： 研 究傳入神經(jīng) 阻滯對(duì)成年 大鼠嗅球 小 白蛋 白( P V) 的影 響情 況。方 法 ： 用 免疫組化 方 法

22、檢測(cè) 損 傷嗅上 皮對(duì) 嗅球 P V的表達(dá) 的影 響。結(jié)果 ： 損傷嗅上 皮導(dǎo)致?lián)p傷 鼻孔 同側(cè)嗅球 中 P V 陽(yáng)性 細(xì)胞數(shù) 目 減 少。結(jié)論 ： 嗅球 中 P V表達(dá) 的降低是受傳入 神 經(jīng)阻 滯 影 響 的 。關(guān)鍵詞 ：成年 大鼠 ；嗅球 ；傳入神 經(jīng)阻滯 ；小白蛋 白KE YW oR D S：a d u l tr a t ；o l f a c t o r yb u l b ： d e a f f e r e n t a t i

23、o n ： p a r r a l b u mi n中圖分類(lèi)號(hào) ： Q 4 2 9 ； R 3 9 2 ． 3 1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ： A文章 編號(hào) ： 1 0 0 0 — 6 8 3 4 ( 2 0 0 5 ) 0 1 — 0 1 1 4 — 0 3小 白蛋 白( p a r v a l b u m i n ， P V) 是一 種重要 的鈣結(jié) 合蛋 白 ，在大鼠嗅球中含量豐富， 但確切功能尚不完全清楚l 1J 。嗅球 由外到 內(nèi)依 次為 ：

24、 嗅神經(jīng)層 ( o l f a c t o r yn e r v el a y e r ， O N L ) ， 嗅小 球 層( g l o m e r u l a rl a y e r ， G L ) ， 外 網(wǎng)織 層( e x t e r na lp l e x i f o I “ Il a y —e r ， E P L ) ， 僧 帽細(xì)胞 層( m i t r a lc e l ll a y e r ， MC L ) ， 內(nèi)網(wǎng)織層

25、( i n —t e ma lp l e x i f o I “ Il a y e r ， I P L) ， 粒 細(xì) 胞 層 ( g r a n u l ec e l ll a y e r ，G C L ) [ 2 l ， 表達(dá) P V 的短軸 突細(xì)胞 主 要局 限于 外 網(wǎng)織層 中? ，與僧帽細(xì)胞 層的僧 帽細(xì)胞 ( M i t r a lC e l 1 ) 及外 網(wǎng)織 層 的叢 細(xì)胞 ( T u f t e dC e l 1 ) 之

26、間形 成交 互 性 突觸 ， 而僧 帽細(xì) 胞 與 嗅小 球?qū)?的小球 周 圍 細(xì)胞 之 間 ( P e r i g l o m e r u l a rc e l 1 ) 也 形 成 交 互 性 突觸[ 3 l 。嗅受體 神 經(jīng) 元 ( o l f a c t o r yr e c e p t o rn e u r o n ， O R N) 位 于 嗅上皮 ， 其軸 突進(jìn) 人到 嗅球 ， 用 Z n S O或燙 傷 法損 傷 嗅上 皮可

27、導(dǎo)致外周 傳人神經(jīng) 阻滯 ( D e a f f e r e n t a t i o n ) ， 前人 常用 此模 型來(lái) 研究阻滯 后嗅球 的變 化 ， 揭 示 受外 周 神經(jīng) 傳 人調(diào) 節(jié) 的蛋 白，其中研 究 最 清 楚 的 是 酪 氨 酸 羥 化 酶 ( t y r o s i n eh y d r o x y l a s e ，T H ) ， 在阻滯后 劇烈下 降L 4 ‘， 而 對(duì) P v 的研 究 僅見(jiàn)一 篇 關(guān)于 新 生

28、鼠及幼 鼠( 出生 后 1 ～3 0d ) 的報(bào)道 ， 尚無(wú) 成 年大 鼠的報(bào) 道 ， 故本文對(duì) 成年 S D大 鼠進(jìn)行 相關(guān)研究 。1 材料與方法 1 ． 1 動(dòng)物及 處理 成年雌性 S D大 鼠， 1 8 0 ～2 2 0g ， 由浙 江 省 醫(yī)科 院提 供 ，實(shí)驗(yàn)組動(dòng) 物戊 巴比妥 鈉麻 醉 后 ， 用 微 量注 射 器 ( 注 射 器針 頭 磨鈍 ) 對(duì)單 邊 鼻 孔 ( 右鼻 孔 ) 灌 注 1 0 0l0 ． 1 7m o

29、l ／ L的 Z n —S O 4 ， 按文獻(xiàn) 的方 法L 1 ‘·， 損 傷鼻 孔 對(duì) 側(cè) 嗅球 ( 左 嗅球 ) 作 為 損傷 鼻孔同側(cè) 嗅球 ( 右 嗅球 ) 的對(duì) 照。損 傷 后 1 0d 、 3 0d 、 6 0d ， 分別取 5 只 大 鼠斷 頭處死 ， 快 速解 剖取左 、 右 嗅球 ， 分別 用 中性 甲醛 固定液 固定 ， 石蠟包埋 ， 對(duì)相 同部 位進(jìn)行 冠 狀切 片 ，7m 厚 。1 ． 2 免疫 組織化

30、學(xué) 染色 免疫組 化 用 A B C法 。二 甲苯 脫蠟 ， 梯 度酒 精 水化 ， 3 ％H 2 0 2 一 P B S 處理 3 0m i n ， 枸椽 酸鹽緩 沖液 9 2 ～9 8℃ 進(jìn)行 抗原 修 復(fù) ， 室 溫下馬血清 孵育 4 0m i n 后 ， 吸 去多余血 清 ， 滴 加一抗 Mo u s ea n t i — p a r v a l b u mi n( C h e mi c o n ) ，1： 20 0 0 ， 室

31、 溫 孵 育 過(guò) 夜 ， 二抗 ： 生物 素化 的 h o r s ea n t i ． m o u s eI g G， 1 ： 2 0 0 ， 室 溫 孵育 3h ， A B C混合 物 1 ： 1 0 0 ( 北 京 中 山生物 公司 ) ， 室溫 孵育 2h ，D A B ( 北 京 中山生物公 司) 呈 色 ， 甲基 綠復(fù) 染 ， 脫 水透 明封 片 。陰性 對(duì)照用 P B S代替一抗 ， 免疫組化 陽(yáng)性者呈 棕紅色 。1 ．

32、3 數(shù) 據(jù)處理 對(duì)損 傷 1 0d 、 3 0d 、 6 0d 后 ， 每一 大 鼠的左 、 右 嗅球切片 分 別 隨機(jī)取 6片 ， 在 光鏡 下 觀察 計(jì) 數(shù) ， 由于 嗅球 面 積小 ， P V 陽(yáng)性細(xì)胞 在嗅球 中數(shù) 量較 少 ， 易于 計(jì) 數(shù) ， 故 對(duì)每 片 切 片進(jìn) 行 陽(yáng)性 細(xì)胞 全計(jì)數(shù) ， 6 片切片 的 陽(yáng)性 細(xì)胞 數(shù) 的均值 作 為每一 嗅 球 的結(jié)果 ， 5 只大 鼠的左 、 右 嗅球的 P v 陽(yáng)性 細(xì)胞數(shù) 分別