RIP140對(duì)膿毒癥急性肺損傷PPARγ調(diào)控作用的研究.pdf

1、ALI/ARDS(急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征)是臨床常見的危急重癥，是由各種因素導(dǎo)致彌漫性肺泡-毛細(xì)血管膜損傷，進(jìn)而引起以非心源性肺水腫和炎癥為病理特征的急性呼吸衰竭。雖然經(jīng)過幾十年的臨床和基礎(chǔ)研究，但目前尚無十分有效的針對(duì)ALI/ARDS的治療措施，其病死率依然高達(dá)40％以上[1]。因此，深入研究ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制，尋找新的有效的治療方法和新藥開發(fā)是目前ALI/ARDS的主要研究方向。
　　過氧化物酶增殖體激活受體γ

2、(Perroxisome proliferator-activated receptor, PPARγ)是核受體超家族一員[2]。研究表明，PPARγ的表達(dá)或活性增強(qiáng)后可產(chǎn)生強(qiáng)力有效的抗炎作用抑制ALI/ARDS過激的炎癥反應(yīng)，從而減輕病理損傷對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用，因此有學(xué)者認(rèn)為PPARγ有可能成為ALI/ARDS的一新的治療靶點(diǎn)[3～6]。但在ALI/ARDS的發(fā)病過程中通常伴隨著PPARγ的表達(dá)及活性下降，其具體調(diào)控機(jī)制不明[6，7]

3、。受體相互作用蛋白（Receptor interacting protein140，RIP140）是PPARγ的一轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子，對(duì)PPARγ的活性起負(fù)調(diào)控作用[8，10]。但目前仍不清楚在ALI/ARDS的發(fā)病過程中RIP140與PPARγ的相互關(guān)系以及其是否對(duì)PPARγ的表達(dá)和活性具有調(diào)節(jié)作用。
　　因此，本研究中我們首先研究了RIP140在ALI/ARDS時(shí)肺組織中及巨噬細(xì)胞的表達(dá)變化，在此基礎(chǔ)上通過基因技術(shù)下調(diào)RIP14

4、0表達(dá)觀察對(duì)PPARγ表達(dá)和活性的影響。從輔助因子層面探討了PPARγ的上游調(diào)控機(jī)制，為PPARγ今后在ALI/ARDS的進(jìn)一步運(yùn)用提供理論基礎(chǔ)。
　　目的:探討膿毒癥肺損傷時(shí)RIP140對(duì)PPARγ的調(diào)控作用，闡明在ALI/ARDS時(shí)PPARγ的上游調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　1.膿毒癥急性肺損傷RIP140在肺組織中的表達(dá)研究
　　通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)復(fù)制大鼠膿毒癥肺損傷模型;隨后，使用免疫組化技術(shù)、Weste

5、rn-blot、激光共聚焦技術(shù)觀察在膿毒癥肺損傷時(shí)RIP140在肺組織中的表達(dá)及定位。
　　2.RIP140對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答時(shí)PPARγ表達(dá)及活性的調(diào)控研究
　　Western-blot技術(shù)觀察在LPS刺激后RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)RIP140和PPARγ的表達(dá)變化。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建RIP140 shRNA腺病毒載體，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的RAW264.7巨噬細(xì)胞，使用RT-PCR、Western blot、ELISA觀察在巨噬

6、細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中下調(diào)RIP140的表達(dá)對(duì)PPARγ表達(dá)活性及對(duì)下游炎性因子的表達(dá)影響。
　　3.下調(diào)RIP140的表達(dá)對(duì)小鼠膿毒癥急性肺損傷肺組織炎癥反應(yīng)的影響
　　首先，通過腹腔注射LPS復(fù)制小鼠膿毒癥肺損傷，Western blot檢測RIP140和PPARγ的表達(dá)變化規(guī)律。隨后，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)RIP140的表達(dá)，Western blot檢測膿毒癥肺損傷時(shí)下調(diào)RIP140對(duì)PPARγ表達(dá)的影響，RT-qPCR、H

7、E染色觀察下調(diào)RIP140是否通過PPARγ影響肺組織炎性因子表達(dá)及病理損傷。
　　結(jié)果:
　　1.成功的復(fù)制了膿毒癥肺損傷動(dòng)物模型，在正常大鼠及假手術(shù)組大鼠的肺泡巨噬細(xì)胞中RIP140呈一較低表達(dá)水平。而CLP后6h，RIP140的表達(dá)水平較對(duì)照組開始升高(P＜0.05)至12～24 h維持一較高水平(P＜0.05)。通過激光共聚焦免疫熒光進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RIP140主要表達(dá)于胞核。
　　2.LPS刺激6h后巨噬細(xì)胞中RI

8、P140的表達(dá)較0h組開始上升（P＜0.01），至12～24h維持在一較高的表達(dá)水平。在RIP140表達(dá)升高的同時(shí)PPARγ的表達(dá)開始下降(P＜0.01)至12h其表達(dá)水平降至最低(P＜0.05)。通過基因技術(shù)下調(diào)RIP140的表達(dá)后PPARγ的表達(dá)及活性即恢復(fù)，這一效應(yīng)可被PPARγ阻斷劑GW9662所抑制。下調(diào)RIP140的表達(dá)可明顯抑制IL-Iβ、TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)及釋放，而這一抗炎效應(yīng)可被GW9662抑制。

9、r>　　3.在LPS刺激后6h小鼠肺組織中RIP140的表達(dá)較0h，3h組開始升高(P＜0.05)，并持續(xù)至24h。與此相反的是，在LPS刺激后6h肺組織中PPARγ的表達(dá)水平較0h，3h組開始下降(P＜0.05)至12～24h為此一較低的水平。通過RIP140 shRNA腺病毒載體下調(diào)小鼠肺組織RIP140表達(dá)發(fā)現(xiàn):RIP140 shRNA+LPS組小鼠肺組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯低于空載體+LPS組

10、(P＜0.05)，但在使用PPARγ阻斷劑GW9662后這些促炎基因的表達(dá)水平的明顯高RIP140 shRNA+LPS組（P＜0.05）。通過HE染色我們進(jìn)一步證實(shí):RIP140 shRNA+LPS組小鼠肺組織病理損傷明顯低于空載體+LPS組，但這一保護(hù)作用可明顯被PPARγ阻斷劑GW9662逆轉(zhuǎn)
　　結(jié)論:
　　1.膿毒癥肺損傷時(shí)RIP140在肺組織中主要表達(dá)于炎性細(xì)胞，通過體外分離培養(yǎng)膿毒癥肺損傷大鼠現(xiàn)肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)一步

11、發(fā)現(xiàn)RIP140在肺泡巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平明顯升高且其主要表達(dá)于胞核;
　　2.成功的構(gòu)建了對(duì)細(xì)胞毒性作用小轉(zhuǎn)染效率高的腺病毒載體，通過該載體攜帶的RIP140shRNA可有效下調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞RIP140表達(dá);下調(diào)巨噬細(xì)胞RIP140的表達(dá)可恢復(fù)炎癥應(yīng)答過程中PPARγ的表達(dá)及活性，從細(xì)胞水平證實(shí)了RIP140對(duì)PPARγ的表達(dá)及活性存在調(diào)控作用;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，下調(diào)巨噬細(xì)胞RIP140的表達(dá)可通過增強(qiáng)PPARγ的表達(dá)及活性，抑制促炎因