膿毒癥肺損傷時(shí)對(duì)HSPA12B有調(diào)控作用的miRNA篩選及其意義.pdf

1、研究背景：
　　膿毒癥及其并發(fā)癥仍是臨床上難以解決的問題。肺損傷是膿毒癥常見的并發(fā)癥之一。目前，臨床上針對(duì)膿毒癥肺損傷大多采取支持治療，缺乏有效的針對(duì)其病理生理機(jī)制的治療手段。因此，對(duì)膿毒癥肺損傷，尤其對(duì)其早期診斷和治療的相關(guān)研究仍十分必要。
　　肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary micro-vascular endothelial cells，PMVECs)是組成肺血屏障的重要成分之一，在肺組織的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)

2、輸，炎癥反應(yīng)及血壓調(diào)節(jié)等方面起著重要作用。大量研究表明:膿毒癥肺損傷時(shí)PMVEC被破壞，導(dǎo)致肺血屏障通透性增加;同時(shí)部分病原微生物及其代謝產(chǎn)物激活PMVEC，進(jìn)而激活凝血系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)系統(tǒng)。因此，維護(hù)PMVEC的功能對(duì)減輕膿毒癥肺損傷至關(guān)重要。
　　HSPA12B是熱休克蛋白70家族的成員之一。與其它70家族成員的廣泛表達(dá)不同，其主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，尤其在肺、腦及腎臟中表達(dá)較多。有研究表明:HSPA12B在膿毒癥時(shí)起著抵抗血

3、管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用。我們研究發(fā)現(xiàn):HSPA12B在膿毒癥患者外周血漿中的含量較正?；颊呙黠@升高，并且可能對(duì)內(nèi)毒素刺激的小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定保護(hù)作用，作用機(jī)制可能與p38磷酸化抑制有關(guān)。因此，HSPA12B有可能成為膿毒癥血管內(nèi)皮損傷的新治療靶點(diǎn)。如果內(nèi)源性HSPA12B表達(dá)增加，則有可能減輕膿毒癥肺損傷。因此，有必要對(duì)HSPA12B基因表達(dá)的調(diào)控因素進(jìn)行研究。
　　目前HSPA12B基因表達(dá)機(jī)制并不清楚。有研究認(rèn)為:轉(zhuǎn)錄

4、后調(diào)控機(jī)制可能參與到了HSPA12B的基因表達(dá)調(diào)控，但是具體機(jī)制并未闡明。常見的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式包括RNA前體的加工、內(nèi)含子的剪接、交替剪接和RNA編輯等內(nèi)容。miRNA是mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式之一。雙鏈miRNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋，其中一條鏈結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，形成非對(duì)稱RISC，該復(fù)合物結(jié)合到目標(biāo)mRNA上起作用。miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控主要是通過對(duì)靶

5、基因轉(zhuǎn)錄體的切割或?qū)D(zhuǎn)錄體翻譯抑制兩種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。這兩種機(jī)制的選擇主要取決于它與靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)的程度。但是哪些miRNA在膿毒癥中表達(dá)發(fā)生改變，這些miRNA是否直接作用于HSPA12B的3'UTR并調(diào)節(jié)HSPA12B基因的表達(dá)，及其調(diào)節(jié)HSPA12B表達(dá)后對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響等，尚未見報(bào)道。針對(duì)上述問題，我們擬進(jìn)行以下幾部分研究。
　　第一部分通過生物信息學(xué)手段對(duì)可能調(diào)節(jié)人HSPA12B基因的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)
　　

6、目的：
　　預(yù)測(cè)出對(duì)HSPA12B有調(diào)節(jié)作用的miRNA，以初步確定研究范圍
　　方法：
　　首先在GenBank--NCBI（核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)）中檢索人類HSPA12B的mRNA序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSPA12B的mRNA存在著多種剪切體。因此，我們進(jìn)一步通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析并明確何種HSPA12B mRNA的剪切體能夠翻譯蛋白質(zhì)。從而選定該條mRNA在targetscan、miRbase和picTar數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)

7、測(cè)可能作用于HSPA12B的miRNA。根據(jù)以上結(jié)果，綜合分析出可能作用于HSPA12BmRNA的miRNA。
　　結(jié)果：
　　發(fā)現(xiàn)13條保守的miRNA序列可能作用于人HSPA12BmRNA3'UTR上，分別為:hsa-miR-3657、 hsa-miR-642a、 hsa-miR-4505、 hsa-miR-3665、 hsa-miR-4736、hsa-miR-940、 hsa-miR-4692、 hsa-miR-451

8、4、 hsa-miR-4742-5p、hsa-miR-4269、hsa-miR-3664-3p、hsa-miR-4518和hsa-miR-1266，其中hsa-miR-4518和hsa-miR-1266的匹配程度不高，不進(jìn)行研究。
　　結(jié)論：
　　Hsa-miR-3657、 hsa-miR-642a、 hsa-miR-4505、hsa-miR-3665、hsa-miR-4736、hsa-miR-940、 hsa-miR-46

9、92、 hsa-miR-4514、 hsa-miR-4742-5p、 hsa-miR-4269、hsa-miR-3664-3p這11條miRNA可能作用于人HSPA12B mRNA3'UTR上，有可能調(diào)控人類HSPA12B基因表達(dá)，值得進(jìn)一步研究。
　　第二部分篩選對(duì)人HSPA12B基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用的miRNA
　　目的：
　　篩選出對(duì)人HSPA12B基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用的miRNA。
　　方法：
　　合成

10、上述預(yù)測(cè)的miRNA mimics，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將這些miRNA轉(zhuǎn)染入HUVEC，使其在HUVEC中高表達(dá)，用qRT-PCR和western-blot檢測(cè)HSPA12B在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，另外用qRT-PCR發(fā)分別檢測(cè)上述miRNA，以明確它們的轉(zhuǎn)染效果。
　　結(jié)果：
　　結(jié)果顯示，與miRNA-NC組比較，轉(zhuǎn)染miRNA mimics組其相應(yīng)的miRNA表達(dá)明顯增加，且HUVEC中miRNA的基礎(chǔ)表達(dá)極低，可忽

11、略不計(jì)hsa-miR-3657 mimic，hsa-miR-4692 mimic，hsa-miR-4742-5p mimic和hsa-miR-4505 mimic轉(zhuǎn)染HUVEC后，細(xì)胞中HSPA12B在mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均較miRNA-NC組低。hsa-miR-4505，hsa-miR-4514，hsa-miR-3664-3p在LPS處理后12h表達(dá)明顯升高（P＜0.001約是未用LPS處理時(shí)的3倍），24h時(shí)其表達(dá)又下降到基礎(chǔ)

12、水平。hsa-miR-1224-3p，hsa-miR-3127-5p，hsa-miR-3657，hsa-miR-4692，hsa-miR-3665在LPS處理后12h表達(dá)上調(diào)（P＜0.001約是未用LPS處理時(shí)的1.5倍），24h時(shí)其表達(dá)又下降到基礎(chǔ)水平。
　　結(jié)論：
　　hsa-miR-4505、hsa-miR-3657、hsa-miR-4692和hsa-miR-4742-5p對(duì)HSPA12B基因的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。hsa-

13、miR-4505、hsa-miR-4514和hsa-miR-3664-3p在LPS刺激的HUVEC中表達(dá)水平發(fā)生改變。結(jié)合這兩部分的研究，我們認(rèn)為hsa-miR-4505對(duì)LPS刺激的HUVEC中HSPA12B基因的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。因此，膿毒癥時(shí)hsa-miR-4505可能對(duì)人HSPA12B基因有表達(dá)調(diào)控作用。
　　第三部分明確hsa-miR-4505對(duì)HSPA12B的調(diào)控位點(diǎn)
　　目的：
　　明確hsa-miR-45

14、05對(duì)HSPA12B的調(diào)控位點(diǎn)。
　　方法：
　　構(gòu)建luciferase（螢火蟲熒光素酶）表達(dá)載體pGL3-promoter-HSPA12B-3'UTR全長(zhǎng)和Hsa-miR-4505結(jié)合位點(diǎn)突變的克隆。分別將它們與pRL（海腎熒光素酶）內(nèi)參質(zhì)粒以及miR-NC和Hsa-miR-4505共同轉(zhuǎn)染HUVEC中，檢測(cè)報(bào)告基因的熒光，計(jì)算熒光比值。
　　結(jié)果：
　　為了驗(yàn)證hsa-miR-4505是否直接作用HSPA1

15、2BmRNA3'UTR上，我們對(duì)HumanHSPA12B基因進(jìn)行了報(bào)告基因的檢測(cè)。我們分別用正常及突變的HSPA12B-3'UTR克隆轉(zhuǎn)染HUVEC，結(jié)果發(fā)現(xiàn):正?？寺⊥琱sa-miR-4505 mimic共轉(zhuǎn)后，其熒光比值較NC組低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.0039)，突變克隆與hsa-miR-4505 mimic共轉(zhuǎn)后，其熒光比值較NC組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　正?？寺⊥琱sa-miR-4505 mimic共轉(zhuǎn)后，

16、其熒光比值較NC組低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，突變克隆與hsa-miR-4505 mimic共轉(zhuǎn)后，其熒光比值較NC組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此可見，hsa-miR-4505直接作用在human HSPA12B mRNA的3'UTR上。
　　第四部分 LPS處理HUVEC時(shí)hsa-miR-4505表達(dá)改變的機(jī)制
　　目的：
　　明確LPS處理HUVEC時(shí)，hsa-miR-4505表達(dá)改變的機(jī)制。
　　方法：
　　按照細(xì)胞傳代

17、中所敘述的步驟將細(xì)胞平均接種于12孔板中，每孔體積為1mL，37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。當(dāng)12孔板中細(xì)胞融合度達(dá)到50％-70％時(shí)，加入事先稀釋好的NF-κB、JNK、ERK和P-38抑制劑處理(分別為NF-κB Activationinhibitor、SP600125、U0126、SB203580)及對(duì)照DMSO處理，根據(jù)試劑說明書預(yù)處理30min-1h后，用LPS處理。處理后12h換液，繼續(xù)培養(yǎng)12h后在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收細(xì)

18、胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　在LPS處理0、12、24小時(shí)后，收細(xì)胞，提取總RNA，用stem-loop法對(duì)hsa-miR-4505進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)NF-κB、JNK、ERK和P-38相應(yīng)的抑制劑處理后，hsa-miR-4505在LPS處理12h后的表達(dá)水平較未處理組明顯下降(P＜0.001)
　　結(jié)論：
　　用stem-loop法對(duì)hsa-miR-4505進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)NF-κB、JNK、ERK

19、和P38抑制劑處理后，hsa-miR-4505在LPS處理后12h的表達(dá)較未處理組明顯下降。因此NF-κB、JNK、ERK和P-38信號(hào)通路對(duì)hsa-miR-4505的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。
　　第五部分 Hsa-miR-4505通過下調(diào)HSPA12B加重LPS誘導(dǎo)的HUVEC損傷
　　目的：
　　明確hsa-miR-4505是否可通過HSPA12B影響LPS誘導(dǎo)的HUVEC損傷。
　　方法：
　　除了HUVE

20、C對(duì)照組(CTR-group)和LPS處理組(LPS-group)外，其余4組分別用 hsa-miR-4505 mimic(Mimic-group)、 miR-NC(NC-group)、pIRES2-EGFP-HSPA12B-3flag質(zhì)粒(HSP-group)、 pIRES2-EGFP-3flag質(zhì)粒(Flag-group)分別轉(zhuǎn)染HUVEC，然后用LPS刺激這4組HUVEC，刺激24h后，用MERSST電阻抗檢測(cè)儀測(cè)量各組的TEER

21、(電阻坑)。分別在Mimic-group和NC-group中，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVEC的ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和VE-cadherin表達(dá)水平，劃痕試驗(yàn)檢測(cè)HUVEC修復(fù)功能。
　　結(jié)果：
　　各組TEER值如下對(duì)照組(CTR-group)為31±1Ω，LPS處理組(LPS-group)為13±1Ω，hsa-miR-4505 mimic轉(zhuǎn)染組(Mimic-group)為24±2Ω，miRNA-NC

22、轉(zhuǎn)染組(NC-group)為42±3Ω，pIRES2-EGFP-HSPA12B-3 flag轉(zhuǎn)染組(HSP-group)為43±3Ω，pIRES2-EGFP-3flag轉(zhuǎn)染組(Flag-group)為25±2Ω。LPS處理組與對(duì)照組比較，TEER有顯著降低(P＜0.001);hsa-miR-4505 mimic轉(zhuǎn)染組與miRNA-NC轉(zhuǎn)染組比較，TEER有顯著降低(P＜0.001);pIRES2-EGFP-HSPA12B-3flag轉(zhuǎn)染

23、組與pIRES2-EGFP-3flag轉(zhuǎn)染組比較，TEER有顯著升高(P＜0.001)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與miRNA-NC轉(zhuǎn)染組(NC-group)相比較， VCAM-1和E-selectin在hsa-miR-4505 mimic轉(zhuǎn)染組的表達(dá)下降(P＜0.05)。劃痕試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):與miRNA-NC轉(zhuǎn)染組(NC-group)相比較，HUVEC的遷移麗積在hsa-miR-4505 mimic轉(zhuǎn)染組(Mimic-group)明顯下降