生長抑素對膿毒癥肺損傷的保護作用及機制探討.pdf

1、研究背景： 膿毒癥是感染、創(chuàng)傷、大手術后和休克等常見的并發(fā)癥，是危重患者死亡的重要原因。膿毒癥可導致多臟器的損傷，在這些受損傷的臟器中，肺臟最易受到各種致病因素的打擊，成為機體失控炎性損害的主要靶器官，這是由于肺臟不僅是氣體交換的器官，也是一些細胞因子和激素等產生和滅活的場所。各種途徑入血的毒素、內源性炎性介質等物質經靜脈回流后首個流經的重要臟器就是肺臟，加上肺臟本身在解剖結構上相對較脆弱，肺循環(huán)具有壓力低、流速慢、面積大的特點

2、，增加了肺臟實質細胞對毒性物質的暴露機會和時間。因此，在諸多臟器中，肺臟也因而成為功能不全發(fā)生率最高和發(fā)生時間最早的器官，并表現為急性肺損傷或/和急性呼吸窘迫綜合征。 關于膿毒癥致肺損傷的確切發(fā)病機制還不清楚，研究認為，急性肺損傷不僅是肺部疾病，也是全身系統(tǒng)炎性疾病的肺部表現，炎性反應和免疫調節(jié)失控導致多形核白細胞、肺泡巨噬細胞等炎性細胞激活，引起多種促炎細胞因子包括腫瘤壞死因子-α、白介素-1β等釋放，并通過細胞間的信息傳導，

3、炎性反應級聯放大，導致肺損傷加重、免疫系統(tǒng)功能破壞，甚至發(fā)展為多器官功能障礙綜合征。多形核白細胞、巨噬細胞等是炎癥反應的效應者和執(zhí)行者，近來研究表明：在巨噬細胞及中性粒細胞上表達的髓樣細胞觸發(fā)性受體1作為細菌和真菌急性炎癥反應的觸發(fā)器和放大劑的角色已受到人們的關注。在細菌感染早期TREM1在單核細胞上的活化具有通過參與免疫反應來幫助宿主抵抗微生物侵犯的作用，它能誘使幾種炎性因子和化學因子如腫瘤壞死因子-a、白介素-8和單核細胞趨化蛋白-

4、1的生成。在細胞內部，TREM1可激活中性粒細胞脫顆粒，誘發(fā)鈣離子轉移，并使細胞表面信號相關激酶1，2和磷脂酶C酪氨酸磷酸化，TREM1連同跨膜受體分子DAP12共同調節(jié)該活化過程，最終可引起炎癥反應的增強、放大，導致“過度”的炎癥反應。在LPS誘導的休克，腹腔注射活的大腸桿菌和盲腸結扎穿孔的急性細菌炎癥動物模型中發(fā)現，采用可溶性TREM1IgG融合蛋白阻斷TREM1信號減少過渡的炎癥反應和死亡，進一步證實TREM1具有防大炎癥反應的作

5、用。而在細菌感染期間，TREM1還具有促進炎性因子分泌的作用，當DAP12在肺中持續(xù)的高表達，TREM1、TREM2分子被誘導出，它們動態(tài)的表達促進促炎細胞因子的釋放。這些提示鑒于TREM1在啟動和增強炎癥反應中的關鍵作用，在機體諸如膿毒癥和急性肺損傷等過度的炎癥反應為特征的疾病，TREM1可作為潛在的治療靶點，調節(jié)TREM1的信號可以幫助改善膿毒癥和急性肺損傷患者的預后。 生長抑素及其類似物是臨床治療急性胰腺炎的有效藥物，已有

6、研究提示其對重癥胰腺炎致肺損傷的治療作用機理與抑制免疫活性細胞功能及雙向調節(jié)炎癥反應有關。但是對于同是過度炎癥反應狀態(tài)的膿毒癥肺損傷，生長抑素是否產生相同的治療作用，而且其信號轉導路徑如何，未見相關報道。而近年研究表明細胞因子信號轉導中的一個新途徑，JAK-STAT信號轉導通路，在組織受傷和感染時釋放的細胞因子使其通路中相應的因子活化并表達升高，過度激活JAK-STAT通路誘導炎癥細胞生成大量的磷酸化JAK和磷酸化STAT已成為內毒素致

7、肺臟損傷機制的新解釋，但相關研究不多。所以本研究擬利用小鼠盲腸結扎穿孔術致膿毒癥肺損傷的動物模型，從動物模型和分子水平觀察生長抑素治療膿毒癥肺損傷后氧分壓、肺濕/干比、髓過氧化物酶(MP0)、病理學指標以及細胞因子TNF-α的變化，并觀察TNF-α、IL-1β及TREM1的基因表達變化、TREM1蛋白表達水平以及JAK-STAT的信號通路變化，旨在闡明生長抑素治療膿毒癥肺損傷的機制，為膿毒癥肺損傷的預防和臨床救治提供一種新的研究思路。

8、 研究目的： 1.觀察生長抑素對膿毒癥致肺損傷小鼠血氧分壓、肺濕干比、肺髓過氧化物酶(MPO)、炎性細胞因子TNF-α水平及肺組織病理的影響，探討生長抑素對膿毒癥肺損傷的保護性作用。 2.觀察生長抑素對膿毒癥肺損傷小鼠肺組織TREM1、TNF-α、IL-1β基因表達及TREM1蛋白表達水平的影響，在分子水平探討生長抑素對膿毒癥肺損傷的保護機制。 3.觀察生長抑素干預對膿毒癥肺損傷小鼠肺組織Jak-Stat信

9、號通路的影響，旨在探討生長抑素對膿毒癥肺損傷的保護作用信號轉導機制。 研究內容： 第一部分：生長抑素對膿毒癥小鼠肺損傷的保護作用 采用盲腸穿孔方法復制膿毒癥肺損傷模型。50只雄性昆明小鼠隨機分為5組：正常對照組，假手術組，膿毒癥組，生長抑素治療1組，生長抑素治療2組，每組10只。生長抑素1組小鼠ALI后0h、6h時間點皮下注射生長抑素50mg/kg(濃度5mg/ml)，生長抑素2組為100mg/kg(濃度10mg

10、/ml)，其余組小鼠注射等量的生理鹽水。于模型成功后12h點，采用左心室穿刺采集小鼠動脈血測定血氧分壓；采用4％中性福爾馬林液固定肺組織，進行HE染色后進行病理評分；采用ELISA法檢測12h血漿TNF-α水平；采用分光光度比色法測定肺組織髓過氧化物酶的活性。 第二部分：生長抑素對膿毒癥肺損傷小鼠TREM1表達的影響 膿毒癥肺損傷模型同第一部分，在致傷后12小時取材，處理標本。Trizol法提取肺組織總mRNA后，RT-

11、PCR分析TREM1、TNF-α、IL-1βmRNA表達水平；采用流式細胞術檢測各組小鼠肺灌洗液中中性粒細胞表面TREM1蛋白的表達；免疫組織化學法檢測各組小鼠肺組織TREM1的表達，并采用光密度軟件分析小鼠肺組織TREM1的表達變化；全細胞裂解法提取各標本總蛋白后，Westernblot法檢測各組肺組織中TREM1蛋白總含量；結合第一部分肺濕干比、髓過氧化物酶的活性，進行相關分析。 第三部分：生長抑素對膿毒癥肺損傷小鼠Jak-

12、Stat信號轉導通路的影響 采用盲腸穿孔方法復制膿毒癥肺損傷模型。9只昆明雄性小鼠隨機分為3組：假手術組，膿毒癥肺損傷組，生長抑素治療組，每組3只。生長抑素組小鼠ALI后0h、6h時間點皮下注射生長抑素100mg/kg，濃度10mg/ml)，其余小鼠注射等量的生理鹽水。于模型成功后12h點，處死小鼠獲取肺組織液氮保存用于基因芯片測定Jak-Stat信號通路的基因表達差異。 研究結果： 第一部分：生長抑素對膿毒癥肺

13、損傷小鼠的肺保護性作用 各組小鼠12h時點氧分壓數據經單因素方差分析，結果顯示組間氧分壓差異有顯著性(F=16.038，P=0.000)。進一步經組間多重比較LSD法分析，結果顯示與正常對照組(99.4±8.5)和假手術組(98.5±6.6)相比，生長抑素治療SS1組(89.2±8.7)PaO2降低差異有顯著性(P<0.01)，SS2(93.3±7.1)組小鼠PaO2稍低，但差異無顯著性(P>0.05)；而與ALⅠ組相比，SS1

14、及SS2治療組小鼠PaO2升高差異有顯著性(P<0.01)，提示不同治療方法隨組別的不同，PaO2變化不同。說明ALI致傷小鼠以后，發(fā)生肺間質水腫以及肺泡上皮損傷，從而影響氣體交換，導致血氧下降，而SS治療則具有提高膿毒癥肺損傷時PaO2的作用。 第二部分：生長抑素治療肺組織TREM1、TNF-α、IL-1βmRNA表達的影響 經單因素方差分析及組間多重比較LSD法分析，結果顯示與Ctrl組(0.065±0.035)和S

15、ham組(0.067±0.032)小鼠肺組織TREM1mRNA表達比較，生長抑素治療SS1組(0.400±0.033)及SS2組(0.374±0.037)表達升高差異有顯著性(P<0.01)，而與ALⅠ組(0.596±0.066)比較，SS1、SS2組表達下降差異有顯著性(P<0.01)。提示膿毒癥肺損傷12h時點TREM1mRNA表達升高，而生長抑素具有抑制TREM1基因轉錄的作用。 第三部分：生長抑素對膿毒癥肺損傷小鼠Jak

16、-Stat信號轉導通路的影響 通過膿毒癥術后12h肺組織的基因芯片分析，結果發(fā)現(1)膿毒癥術后12h，有57個基因出現差異表達，其中表達上調者40個，下調者17個。其中涉及到JAK/STAT通路的基因、耦聯及激活Jak蛋白的受體、核轉位、Stat蛋白磷酸化、轉錄正性/負性調節(jié)、信號傳導激活、免疫反應、凋亡等。從上調及下調基因功能的差別看，上調基因如Jak2、Cxc19、I120、Nos2、Stat1、Stat3等主要是正性調節(jié)

17、信號傳導轉錄激活、炎癥反應、抗凋亡基因等基因，下調基因主要是負性調節(jié)轉錄因子的激活、促進凋亡的基因、抑制免疫反應及炎癥反應的基因等。上游信號通路不同功能的轉錄信號差異從一定程度上啟動了下游促炎細胞因子的信號的轉位、復制，轉錄激活的不同，導致了促炎細胞因子與抑炎細胞因子的不平衡，這可能是膿毒癥機體促炎因子與抗炎因子之間的平衡發(fā)生變化的根本原因。 結論： 生長抑素能明顯抑制膿毒癥肺損傷小鼠肺中性粒細胞等炎性細胞表面髓樣細胞觸