Ser-313低磷酸化IκBβ對膿毒癥肺損傷保護作用的研究.pdf

1、膿毒癥是由各種直接或間接感染因素引起的全身性免疫及炎癥反應，層級放大的反應程度?？梢鸲嗯K器功能障礙甚至衰竭。作為機體氣體交換中心的肺臟對炎癥反應敏感，膿毒癥導致的肺損傷常可帶來致命后果。膿毒癥所致的肺損傷通常為急性炎癥性肺損傷，以肺部炎癥細胞浸潤為主要表現(xiàn)，膿毒癥時因為機體調(diào)控出現(xiàn)紊亂，過度放大的炎癥反應可加重肺損傷，而且我們認為此時中性粒細胞趨化的適度減弱反而對臟器保護有利。因此探尋減輕膿毒癥肺損傷肺部炎癥反應的途徑是一個可行的保護

2、膿毒癥后肺臟的方法。
　　NF-κB是重要的核基因轉(zhuǎn)錄因子。正常細胞中NF-κB二聚體與NF-κB抑制蛋白(IκB)相結(jié)合，以無活性形式分布于胞漿中。受到LPS刺激后，IκB被降解并活化NF-KB，使其移位到細胞核發(fā)揮調(diào)控基因表達的作用。IκBβ蛋白的磷酸化和去磷酸化是其功能調(diào)節(jié)的基礎。有研究發(fā)現(xiàn)IκBβ敲除后的小鼠對過度炎癥反應所致臟器功能損傷的保護能力顯著下降。這間接說明IκBβ可能對過度炎癥反應造成的臟器損傷有保護作用。

3、r>　　正常的IκBβ的C端(|)有2個酪蛋白激酶（casein kinase）活化的絲氨酸磷酸化位點Ser-313和Ser-315，細胞受到LPS刺激時，這種兩個位點均磷酸化的IκBβ蛋白降解，隨后啟動再合成過程，但再合成的IκBβ處于低磷酸化狀態(tài)，它與細胞核中游離的NF-κB結(jié)合，與之持續(xù)作用。由此看來，Ser-313或Ser-315位點低磷酸化的IκBβ可能對NF-κB相關通路引起的針對內(nèi)源性和外源性毒素的免疫應答存在作用。Ser

4、-313低磷酸化的IκBβ對趨化因子是否有調(diào)控作用未見明確報道。通過Ser-313位點突變，使Ser-313位無法磷酸化生成低磷酸化IκBβ，可以針對這些設想進行研究。我們構(gòu)建了過表達Ser-313低磷酸化IκBβ的轉(zhuǎn)基因小鼠，建立其膿毒癥模型后對Ser-313低磷酸化IκBβ的存在、分布和對炎癥的調(diào)控、膿毒癥后小鼠死亡率、膿毒癥肺損傷的評估及肺部中性粒細胞趨化進行研究，模擬臨床患者膿毒癥的過程，以期揭示Ser-313低磷酸化的IκBβ

5、在機體膿毒癥后對肺損傷的保護作用和其機制。
　　第一部分 Ser-313低磷酸化IκBβ轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建、低磷酸化IκBβ相關研究及其對膿毒癥小鼠的保護作用
　　研究目的:對Ser-313低磷酸化IκBβ的表達、分布進行探究;初步研究其對膿毒癥后全身炎癥反應的作用;通過死亡率探究其對膿毒癥后小鼠的保護作用。
　　研究方法:構(gòu)建Ser-313點突變而使該位不能磷酸化的低磷酸化IκBβ轉(zhuǎn)基因小鼠。建立小鼠的由盲腸結(jié)扎穿刺(C

6、LP)導致的膿毒癥模型。對轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠膿毒癥模型后組織行IκBβ基因轉(zhuǎn)錄及蛋白的檢測。針對IκBβ進行免疫共沉淀檢測。研究轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的死亡率。對膿毒癥模型后小鼠循環(huán)內(nèi)的兩種主要炎癥因子TNF-α和IL-6進行檢測。
　　研究結(jié)果:成功構(gòu)建Ser-313低磷酸化IκBβ轉(zhuǎn)基因小鼠，自行繁殖、鑒定，并驗證其可持續(xù)表達Ser-313低磷酸化的IκBβ。建立小鼠CLP膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠的生存率顯著優(yōu)于野生型小鼠，

7、術(shù)后24小時，野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的生存率分別是60％和100％，術(shù)后64小時，野生型小鼠完全死亡，轉(zhuǎn)基因小鼠的生存率達到50％。發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠CLP后，組織內(nèi)Ser-313位磷酸化的IκBβ占總IκBβ的比值分別為3h-0，6h-17.5％，12h-54.1％，24h-73.9％，說明膿毒癥早期正常的IκBβ均被降解，新合成的IκBβ大多是Ser-313低磷酸化的IBβ。膿毒癥后野生型小鼠組織中IκBβmRNA的水平穩(wěn)定地增加，在術(shù)后

8、12小時達到極大值，與膿毒癥后總IκBβ蛋白量的變化趨勢相符。發(fā)現(xiàn)Ser-313低磷酸化IκBβ在細胞核內(nèi)與p105/p50，p65(Rel A)和Rel B4種NF-κB蛋白存在相互作用，與c-Rel之間可能不存在相互作用。發(fā)現(xiàn)Ser-313低磷酸化IκBβ的轉(zhuǎn)基因小鼠膿毒癥后血清中TNFα和IL-6濃度均較野生型小鼠低，說明Ser-313低磷酸化的IκBβ能夠降低促炎細胞因子的表達。
　　研究結(jié)論: Ser-313低磷酸化Iκ

9、Bβ在細胞核內(nèi)與p105/p50，p65(Rel A)和Rel B存在相互作用;能降低小鼠膿毒癥后死亡率，調(diào)控炎癥反應。
　　第二部分 Ser-313低磷酸化IκBβ通過調(diào)控小鼠膿毒癥后促炎趨化作用而對膿毒癥肺損傷起保護作用
　　研究目的:探索Ser-313低磷酸化IκBβ對膿毒癥后小鼠肺組織的保護效果;探索其與膿毒癥后肺組織炎癥細胞趨化的關系。
　　研究方法:對兩種小鼠膿毒癥后的肺部組織行HE染色觀察肺部損傷程度，進

10、行肺損傷評分。測定肺組織干濕比。對肺組織切片行CD11b免疫組化染色。制備兩種小鼠肺組織基因芯片，對基因芯片提示有表達量變化的主要趨化因子進行realtime PCR檢測。選取最主要的中性粒細胞趨化因子CXCL1和CXCL2進行肺組織蛋白的ELISA檢測和Western Blotting檢測。
　　研究結(jié)果:發(fā)現(xiàn)Ser-313低磷酸化IκBβ轉(zhuǎn)基因小鼠CLP后肺損傷較野生型小鼠明顯減輕，中性粒細胞浸潤減少。CLP術(shù)后24h時，野生

11、型小鼠的肺損傷評分明顯高于轉(zhuǎn)基因小鼠（10分vs6分，p＜0.01），肺干濕比野生型小鼠vs轉(zhuǎn)基因小鼠為3.79±0.12vs2.56±0.11(n=3，p＜0.01)。CD11b免疫組化染色表明轉(zhuǎn)基因小鼠在膿毒癥后肺部中性粒細胞浸潤較野生型小鼠少。兩種小鼠CLP術(shù)后12小時肺組織基因芯片KEGG富集分析顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠膿毒癥后在趨化因子信號通路的基因轉(zhuǎn)錄明顯低于于野生型小鼠，最主要的中性粒細胞趨化因子CXCL1和CXCL2均相對于野生

12、型小鼠轉(zhuǎn)錄下調(diào)。小鼠肺組織Realtime PCR檢測顯示轉(zhuǎn)基因小鼠膿毒癥后肺組織9種趨化因子mRNA的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，結(jié)果與基因芯片相似。ELISA和Western Blotting的結(jié)果基本一致，證實兩種小鼠CLP后中性粒細胞的主要趨化因子CXCL1和CXCL2表達差異明顯，在CLP術(shù)后6小時和12小時，轉(zhuǎn)基因小鼠表達均明顯低于野生型小鼠。
　　研究結(jié)論:Ser-313低磷酸化的IκBβ對小鼠膿毒癥肺損傷有明確的保護作用。其保護機制