大鼠2-AAF-PH模型中庫普弗細(xì)胞促卵圓細(xì)胞擴(kuò)增及肝臟保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:
　　 目的:觀察脂質(zhì)體包裹氯膦酸二鈉剔除大鼠肝臟庫普弗細(xì)胞的作用，以及剔除后庫普弗細(xì)胞再生恢復(fù)的情況。
　　 方法:正常大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組大鼠給予脂質(zhì)體包裹的氯膦酸二鈉，對照組給予等量生理鹽水。RT-PCR檢測庫普弗細(xì)胞受體KCR mRNA的表達(dá)情況；尾靜脈注射印度墨汁判斷庫普弗細(xì)胞吞噬碳素顆粒的情況；組化檢測庫普弗細(xì)胞標(biāo)記物ED1和ED2的表達(dá)情況。給藥后不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，動態(tài)觀察ED1、

2、ED2陽性細(xì)胞數(shù)目變化。
　　 結(jié)果:給藥后2天RT-PCR檢測不到肝臟庫普弗細(xì)胞受體mRNA的表達(dá)，肝竇內(nèi)吞噬碳素顆粒的庫普弗細(xì)胞消失，ED1、ED2陽性細(xì)胞基本消失。給藥后第8天ED1陽性細(xì)胞開始明顯增多，至第11天其數(shù)目基本恢復(fù)正常。ED2陽性細(xì)胞至第11天開始增加，但平均每中倍視野仍僅有（4.8±1.7）個(gè)細(xì)胞，明顯少于對照組的（17.7±2.1）個(gè)細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。
　　 結(jié)論:靜脈單次

3、注射合適劑量的脂質(zhì)體包裹氯膦酸二鈉能在2天內(nèi)有效剔除肝臟庫普弗細(xì)胞，剔除效果可持續(xù)至少一周時(shí)間。成功建立剔除肝臟庫普弗細(xì)胞的動物模型，為我們后續(xù)研究庫普弗細(xì)胞功能的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：
　　 目的:庫普弗細(xì)胞可以通過釋放多種因子在肝細(xì)胞介導(dǎo)的肝再生過程中扮演重要角色。前期研究顯示，誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞增殖的動物模型中也發(fā)現(xiàn)庫普弗細(xì)胞大量存在于門脈區(qū)，因此我們推測庫普弗細(xì)胞在卵圓細(xì)胞介導(dǎo)的肝再生中也可能起重要作用。本

4、部分通過建立大鼠2-AAF/PH卵圓細(xì)胞介導(dǎo)肝再生模型，觀察剔除庫普弗細(xì)胞后卵圓細(xì)胞擴(kuò)增的變化，旨在探討庫普弗細(xì)胞對卵圓細(xì)胞增殖擴(kuò)增的作用。
　　 方法:將2-AAF/PH卵圓細(xì)胞增殖模型大鼠隨機(jī)分為庫普弗細(xì)胞剔除組和非剔除對照組。術(shù)前48小時(shí)剔除庫普弗細(xì)胞，對照組給予等劑量生理鹽水，術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠。計(jì)算殘肝重量/體重比值評估殘肝再生程度；免疫組化檢測EpCAM、PCK和PCNA并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算門脈區(qū)周圍嗜堿性新

5、生小管樣反應(yīng)面積，以評估卵圓細(xì)胞增殖程度；免疫熒光雙標(biāo)檢測EpCAM和PCNA共表達(dá)情況檢測卵圓細(xì)胞增殖率；Caspase-3組化和TUNEL染色檢測卵圓細(xì)胞凋亡個(gè)數(shù)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肝臟白蛋白和甲胎蛋白mRNA表達(dá)水平；分離2-AAF/PH大鼠術(shù)后肝臟庫普弗細(xì)胞，收集無血清培養(yǎng)液上清；免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清及肝臟組織勻漿中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）表達(dá)水平；Western Blot檢

6、測肝臟STAT3和磷酸化STAT3的表達(dá)情況；EpCAM和α-SMA免疫熒光雙標(biāo)檢測卵圓細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞相互關(guān)系。
　　 結(jié)果:剔除庫普弗細(xì)胞后2-AAF/PH大鼠殘肝再生受抑，術(shù)后第9天卵圓細(xì)胞數(shù)目及門脈區(qū)增殖小管樣面積也顯著減少。同時(shí)，剔除組大鼠卵圓細(xì)胞分化也受抑制或被延遲。術(shù)后第9天對照組大鼠可見大量新生小肝細(xì)胞，而剔除組大鼠卵圓細(xì)胞仍然處于幼稚形態(tài)。并且，對照組肝臟甲胎蛋白mRNA水平下調(diào)，白蛋白mRNA水平明顯上調(diào)。說

7、明剔除庫普弗細(xì)胞后卵圓細(xì)胞增殖分化均受抑制。然而，卵圓細(xì)胞增殖率及凋亡細(xì)胞數(shù)在兩組間沒有顯著差異；剔除庫普弗細(xì)胞也不會影響肝星狀細(xì)胞和卵圓細(xì)胞的相互作用，以及肝細(xì)胞生長因子（HGF）的合成釋放。提示剔除庫普弗細(xì)胞并不影響卵圓細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期后的增殖動力學(xué)，而可能在更早的階段產(chǎn)生影響。分離2-AAF/PH大鼠術(shù)后6小時(shí)的肝臟庫普弗細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6濃度顯著增高,這兩個(gè)經(jīng)典的炎癥因子是啟動肝再生的重要因子，主要由庫普弗細(xì)胞

8、分泌,而剔除庫普弗細(xì)胞可以導(dǎo)致術(shù)后急性期肝臟的TNF-α和IL-6水平下降，同時(shí)引起下游核因子STAT3磷酸化水平下降。
　　 結(jié)論:2-AAF/PH模型中庫普弗細(xì)胞可能通過分泌重要增殖刺激因子TNF-α和IL-6，并激活下游STAT3磷酸化，在術(shù)后急性期對卵圓細(xì)胞的激活起到重要促進(jìn)作用。
　　 第三部分：
　　 目的：庫普弗細(xì)胞是炎癥介質(zhì)的主要來源，參與肝損傷過程，但同時(shí)也能發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。2-AAF/PH激

9、活卵圓細(xì)胞增殖的模型中，庫普弗細(xì)胞是表現(xiàn)出介導(dǎo)肝損傷的作用還是肝保護(hù)的作用是本部分研究的重點(diǎn)。
　　 方法：將2-AAF/PH卵圓細(xì)胞增殖模型大鼠隨機(jī)分為庫普弗細(xì)胞剔除組和非剔除對照組。記錄并統(tǒng)計(jì)大鼠術(shù)后生存率；留取術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)肝臟標(biāo)本及血清樣本，檢測兩組血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）濃度變化；肝臟切片HE染色觀察術(shù)后肝臟損傷情況；Caspase-3免疫組化及TUNEL染色檢測肝細(xì)胞凋亡情況；ELISA

10、檢測肝臟IL-10蛋白水平變化。
　　 結(jié)果：對照組注射生理鹽水的所有2-AAF/PH模型大鼠均良好存活，而剔除庫普弗細(xì)胞的大鼠死亡率增高，僅有少數(shù)能存活到術(shù)后第9天(P<0.01)；肝組織切片HE染色顯示剔除庫普弗細(xì)胞后，肝臟可見明顯肝細(xì)胞變性及片狀壞死灶；剔除庫普弗細(xì)胞的大鼠肝切除術(shù)后AST和ALT水平較對照組升高更明顯，且恢復(fù)正常較緩慢，至術(shù)后第9天仍高于對照組。剔除組術(shù)后24小時(shí)caspase-3陽性及TUNEL陽性凋亡