復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清干預(yù)庫(kù)普弗細(xì)胞對(duì)肝星形細(xì)胞增殖和活化影響的研究.pdf

1、目的肝星形細(xì)胞(HSC)的激活受到包括肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞(KC)、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞產(chǎn)生的各類細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。庫(kù)普弗細(xì)胞條件培養(yǎng)基(KCCM)中KC分泌的各種細(xì)胞因子能促進(jìn)HSC激活。本研究旨在探討KCCM與HSC應(yīng)答反應(yīng)之間以及HSC增殖和活化的影響，以及復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清對(duì)其的干預(yù)作用，為簡(jiǎn)述中醫(yī)藥防治肝纖維化作用機(jī)制進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 藥物復(fù)方鱉甲軟肝方(片)原料粉(不含輔料)由內(nèi)蒙古中蒙藥科技股份有限公司提

2、供。本實(shí)驗(yàn)采取的復(fù)方鱉甲軟肝方由鱉甲、黨參等十一味中藥組成。其主要功能為扶正祛邪，活血化瘀。扶正：黨參健脾益氣，紫河車益腎填精。驅(qū)邪：板藍(lán)根清熱解毒?；钛觯瑚M甲，入肝、腎經(jīng)，既可軟煎散結(jié)，又可滋陰潛陽(yáng)。當(dāng)歸：養(yǎng)血活血。莪術(shù)：行氣祛瘀。其臨床有效率達(dá)81.67％，治愈率達(dá)55.23％。 方法1.造模：健康SD大鼠30只，分成2組，即模型組20只、正常組10只。參照并改進(jìn)Hernandez-Munoz法建立肝纖維化動(dòng)物模型，腹腔

3、注射0.2mlCCL4(花生油1：6稀釋)，每周三次，共六周。 2.制備藥物血清：將復(fù)方鱉甲軟肝方按人體劑量的3.5倍、7倍、14倍制備成低、中、高三個(gè)劑量組，按1ml/100g(每毫升分別含藥物0.035g、0.07g、0.14g)0大鼠體重分別給大鼠灌胃7次，每次間隔12小時(shí)，第7次給藥前12小時(shí)禁食。對(duì)照組給予蒸餾水灌胃，方法同上。 3.原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)：采用Collagenase原位肝臟灌流法，nycodenz

4、梯度密度離心分離HSC、KC。 4.KCCC的制備：KC培養(yǎng)48小時(shí)，收集培養(yǎng)液，0，22um微孔濾器過(guò)濾，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ脮r(shí)與含10％新生牛血清DMEM培養(yǎng)基按1：16、1：8、1：4稀釋。 5.實(shí)驗(yàn)以正常大鼠為陰性對(duì)照，分別采用①M(fèi)TT方法觀察復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清干預(yù)KCCM對(duì)HSC增殖的影響；②免疫組織化學(xué)的方法觀察復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清干預(yù)KCCM對(duì)HSC表達(dá)α-SMA和TGF-β1的影響；③western

5、-blot方法觀察觀察復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清干預(yù)KCCM對(duì)HSC表達(dá)TGF-β1的影響。 6.采用SPSS11.0軟件對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，求平均數(shù)，作單因素方差分析。 開展的相關(guān)實(shí)驗(yàn)：1.分離肝纖維化大鼠肝臟KC和正常大鼠KC、HSC，培養(yǎng)并鑒定2.復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清干預(yù)KCCM對(duì)HSC增殖的影響3.復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清干預(yù)KCCM對(duì)HSC表達(dá)α-SMA的影響4.復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清干預(yù)KCCM對(duì)HSC

6、分泌TGF-β1的影響 5.復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清干預(yù)KCCM對(duì)HSC中TGF-β1蛋白表達(dá)的影響通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及各指標(biāo)之間關(guān)系的深入探討，研究結(jié)果如下：1.KCCM內(nèi)的細(xì)胞因子能促進(jìn)HSC增殖、活化、表達(dá)α-SMA、分泌TGF-β1、增加TGF-β1蛋白表達(dá)水平；尤以MKCCM促進(jìn)作用更強(qiáng)烈。提示MKCCM內(nèi)細(xì)胞因子活性更強(qiáng)。 2.復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清可顯著抑制MKCCM所致HSC增殖。提示復(fù)方鱉甲軟肝方具有抑制HS

7、C增殖、進(jìn)而抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展的作用。 3.復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清可顯著抑制MKCCM所致HSC表達(dá)α-SMA。提示復(fù)方鱉甲軟肝方具有抑制HSC活化、進(jìn)而抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展的作用。 4.復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清可顯著抑制MKCCM所致HSC分泌TGF-β1。提示提示復(fù)方鱉甲軟肝方具有抑制HSC向MFB轉(zhuǎn)化進(jìn)程、抑制肝細(xì)胞的再生，又促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡的作用。 5.復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清可顯著抑制MKCCM所致

8、HSC的TGF-β1蛋白表達(dá)。提示提示復(fù)方鱉甲軟肝方可以從蛋白水平發(fā)揮治療作用。 6.上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明肝纖維化是多細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與的結(jié)果，KC和HSC之間存在復(fù)雜的關(guān)系。復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清的上述抗肝纖維化作用，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的作用機(jī)制。 結(jié)論通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出以下結(jié)論：1.KCCM可促進(jìn)HSC增殖和活化。2.復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清可顯著抑制KCCM所致HSC活化。3.復(fù)方鱉甲軟肝方藥物血清可