低轉(zhuǎn)染效率細(xì)胞同源重組效率的檢測(cè).pdf

1、基因組編輯技術(shù)是利用人工核酸內(nèi)切酶對(duì)特定的目的基因進(jìn)行修飾和改造，引入DNA片段或造成目的基因缺失的一種技術(shù)。目前應(yīng)用最廣泛的是CRISPR/Cas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行高效快捷地改造，實(shí)現(xiàn)目的基因的敲入或者敲除，從而定向改變物種的遺傳信息。該技術(shù)主要應(yīng)用到探究物種基因的功能及作用機(jī)理、構(gòu)建模式動(dòng)物、基因治療等方面。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用到靶位點(diǎn)上會(huì)導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞啟動(dòng)同源重組修復(fù)（HDR）或者非同源末端連

2、接修復(fù)（NHEJ）。非同源末端連接修復(fù)可以引起堿基移碼突變，實(shí)現(xiàn)基因沉默；而同源重組修復(fù)可以實(shí)現(xiàn)基因的定向改造。大多數(shù)情況下，為了提高實(shí)驗(yàn)成功率，在使用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)基因定向改造前，需要篩選出高效的靶位點(diǎn)。如今，基因組編輯效率的檢測(cè)手段有很多種，主要是檢測(cè)NHEJ效率，而很少有檢測(cè)HDR效率，但是在很多研究中，對(duì)基因組進(jìn)行修飾主要用的是同源重組修復(fù)途徑。
　　本研究致力于HDR效率的檢測(cè)。選取小鼠母源印記Meg3基因

3、作為研究對(duì)象，確定該基因位置的10個(gè)gRNA位點(diǎn)，用兩種細(xì)胞系作為受體細(xì)胞來(lái)檢測(cè)10個(gè)位點(diǎn)同源重組效率。一種是容易培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞系，首先將小鼠Meg3基因的3'和5'大小約3kb左右DNA序列擴(kuò)增出來(lái)，然后導(dǎo)入293T細(xì)胞的基因組中，以該細(xì)胞系作為平臺(tái)，利用改良后的擴(kuò)增片段酶切分析（AFDA）檢測(cè)方法檢測(cè)10個(gè)位點(diǎn)同源重組效率；另一種是小鼠ES細(xì)胞，由于ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染難度大，本課題通過(guò)摸索優(yōu)化ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件，最終確定利用電轉(zhuǎn)染

4、法，電轉(zhuǎn)程序?yàn)?A-013，轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量滿足2-4×106個(gè)，轉(zhuǎn)染效率能都達(dá)到10％-20%，由于該效率還不能達(dá)到后續(xù)檢測(cè)要求，我們?cè)贑as9質(zhì)粒中引入一段綠色熒光蛋白基因，能隨Cas9蛋白一起表達(dá)而不影響Cas9蛋白作用，然后利用流式細(xì)胞儀分選出帶綠色熒光的細(xì)胞，剔除未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，間接提高轉(zhuǎn)染效率，最終ES細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)于達(dá)到90%，同樣利用擴(kuò)增片段酶切分析檢測(cè)方法檢測(cè)10個(gè)位點(diǎn)的同源重組效率。利用容易培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染的293T細(xì)

5、胞為受體細(xì)胞檢測(cè)出小鼠Meg3基因10個(gè)位點(diǎn)的同源重組效率，篩選出3'-1和5'-4高效率位點(diǎn)，但是293T細(xì)胞中的基因環(huán)境與小鼠細(xì)胞中的基因環(huán)境有所不同，可能導(dǎo)致每個(gè)靶位點(diǎn)的同源重組效率也會(huì)不同，我們又用 ES細(xì)胞為受體細(xì)胞同樣檢測(cè)這10個(gè)位點(diǎn)的同源重組效率，得到結(jié)果也是3'-1和5'-4兩個(gè)位點(diǎn)效率最高，而且兩批結(jié)果其他靶位點(diǎn)效率高低也基本一致，說(shuō)明293T細(xì)胞基礎(chǔ)上檢測(cè)的結(jié)果是可靠的。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造性建立了一種利用易培養(yǎng)易轉(zhuǎn)染細(xì)胞系檢