皮質(zhì)酮通過Mfn2介導線粒體損傷對雞胚心臟發(fā)育的影響.pdf

1、流行病學研究表明，胎兒時期不良的宮內(nèi)環(huán)境會導致成年期高血壓、心臟肥大、胰島素抵抗（Insulin resistance,IR）、2型糖尿病和精神心理障礙等一系列疾病的風險增加。孕婦產(chǎn)前應激狀態(tài)下，大量分泌的皮質(zhì)激素（Corticosteroides），能夠直接或間接通過胎盤屏障進入宮內(nèi)影響胚胎發(fā)育。近年來更有大量的動物試驗及臨床研究表明，妊娠期過度的糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid,GC）暴露與胎兒生長受限、成年期心血管及內(nèi)分泌

2、代謝等系統(tǒng)性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中對于心臟的副作用更是包括了短期和長期的影響，因此成為目前研究的關(guān)注點之一。然而，關(guān)于類固醇皮質(zhì)激素對胚胎心臟發(fā)育的影響及損傷機制尚未深入闡明。同時，考慮到目前用于研究產(chǎn)前皮質(zhì)類激素暴露對胚胎發(fā)育影響過程中胎生動物模型存在胚胎內(nèi)環(huán)境無法接觸的局限性。因此，本課題將分別采用雞胚模型觀察應激激素皮質(zhì)酮（Corticosterone,CORT）對胚胎心臟發(fā)育的影響，并結(jié)合CORT負荷H9C2細胞模型研究和

3、探討其內(nèi)在的分子機理。
　　首先，我們建立 CORT負荷誘導心臟發(fā)育障礙的雞胚模型。通過向EDD3（Embryo development day3）雞胚氣室隔天注射一系列濃度的CORT（0.5、2.5、5、10nmol/egg），模擬胚胎生長的高皮質(zhì)類激素暴露環(huán)境，繼續(xù)孵育至EDD14結(jié)束。為確定外源性注射的CORT能夠進入胚胎體內(nèi)影響心臟發(fā)育，我們通過HPLC-UV方法檢測胚胎血漿中CORT的含量，并對胚體及心臟進行稱重，統(tǒng)計心

4、臟的相對重量、死亡率等指標。體視鏡下觀察胚胎心臟的外部形態(tài)特征并拍照，經(jīng)固定、包埋、切片及H&E病理染色觀察胚胎心臟的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。實驗結(jié)果顯示，外源性注射的CORT能夠被雞胚吸收，血漿中CORT水平顯著上升，導致胚胎死亡率增加、生長發(fā)育遲緩、而心臟相對重量卻顯著上升，且一定范圍內(nèi)與CORT濃度呈劑量相關(guān)性。在此基礎上我們選擇了CORT2.5nmol和5nmol進行后續(xù)實驗。形態(tài)學結(jié)果顯示，CORT負荷雞胚胎的心臟整體體積增大并伴隨有心

5、室腔擴大、室壁變薄，室壁心肌細胞密度降低、間距增大等內(nèi)部形態(tài)特征，同時進一步麥胚凝集素（Wheat germ agglutinin,WGA）染色結(jié)果顯示單個心肌細胞橫截面積明顯增大。為進一步觀察CORT對心臟病理學變化的影響，通過超聲心動圖（Echocardiography）評價其心臟功能狀況，檢測結(jié)果顯示CORT導致胚胎心臟收縮功能下降，表現(xiàn)為射血分數(shù)和短軸縮短率顯著下降。通過免疫熒光標記技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)CORT負荷能夠抑制心肌細胞的增

6、殖、促進心肌細胞凋亡的發(fā)生，同時增加心臟肌球蛋白的表達。RT-PCR檢測結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CORT作用后心臟肌動蛋白（Actinαcardiac muscle l,ACTC-1）的mRNA水平顯著升高。以上結(jié)果提示，CORT能夠抑制心肌細胞增殖而促進凋亡，刺激細胞向肥大表型轉(zhuǎn)變，造成心臟異常肥大，收縮功能降低。
　　基于心臟組織代謝活躍、能量需求高、線粒體含量豐富等特點，臨床上一系列心臟疾病的發(fā)生發(fā)展均與線粒體代謝功能異常息息相關(guān)。相

7、關(guān)研究表明，線粒體功能異常被認為是促進心肌病理肥大變化及向心衰轉(zhuǎn)變的主要發(fā)病機理之一。為此，本課題進一步研究了CORT對雞胚心肌組織中線粒體功能的影響。向EDD3雞胚氣室隔天注射CORT（2.5和5nmol）后，孵育至EDD14取雞胚心臟組織，使用線粒體分離試劑盒提取心肌細胞線粒體，采用流式細胞儀檢測線粒體膜電位ψm及通過熒光酶標儀實時監(jiān)測線粒體內(nèi)ROS的生成速率，HPLC法測定肥大心肌組織中能量物質(zhì)ATP含量變化。此外，利用試劑盒分別

8、對心肌組織內(nèi)氧化和抗氧化能力指標、線粒體呼吸鏈復合物活性進行測定。結(jié)果顯示，CORT負荷能夠顯著影響雞胚心肌細胞的線粒體功能，具體表現(xiàn)為ψm下降、ROS產(chǎn)生速率增加、ATP含量顯著下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增加而抗氧化酶MnSOD活性和抗氧化分子GSH/GSSG相對量卻顯著降低。同時，CORT負荷也會導致雞胚心肌細胞中線粒體呼吸鏈復合物活性III、IV、V顯著下降。此外，通過透射電鏡我們還觀察到雞胚注射CORT后，心肌細胞中的線粒體

9、出現(xiàn)聚集呈簇等異?，F(xiàn)象。以上結(jié)果提示，CORT負荷會導致雞胚心肌細胞中線粒體形態(tài)及功能異常。
　　線粒體融合蛋白2（Mitofusin2,Mfn2）蛋白是一種介導線粒體融合的重要蛋白，參與維持線粒體動力學平衡及結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)。近期有研究在嚙齒類動物應激模型中發(fā)現(xiàn)，應激產(chǎn)生的激素CORT能夠通過調(diào)控Mfn2表達而影響腦組織的線粒體結(jié)構(gòu)及功能。因此，我們猜想CORT負荷導致胚胎心臟發(fā)育紊亂且伴隨線粒體功能障礙是否涉及Mfn2的表達異常。利用

10、Western Blotting檢測雞胚心肌組織Mfn2蛋白表達變化，結(jié)果表明，CORT負荷組雞胚心肌組織中Mfn2蛋白表達水平較對照組明顯上調(diào)。
　　為了進一步驗證CORT引起心肌細胞肥大確實是與Mfn2介導的線粒體功能缺陷有關(guān)，本課題采用CORT（200μM，48h）負荷大鼠胚胎心肌細胞H9C2建立體外模型，實驗分為Control、CORT以及CORT+GR拮抗劑（Ru486）三組，觀察CORT對H9C2細胞形態(tài)的影響，Mfn

11、2蛋白水平以及線粒體膜電位的變化，同時通過Western Blotting檢測細胞水平凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。最后在單獨轉(zhuǎn)染過表達Mfn2蛋白情況下，檢測其對心肌細胞結(jié)構(gòu)及凋亡的影響，進一步驗證CORT導致心臟肥大發(fā)育異常是通過調(diào)控Mfn2而實現(xiàn)的。結(jié)果顯示，H9C2細胞經(jīng)CORT作用后，出現(xiàn)與雞胚實驗相同的結(jié)果，CORT能夠?qū)е滦募〖毎w積變大，細胞水平Mfn2蛋白表達上調(diào)，線粒體膜電位ψm降低以及Bcl-2蛋白家族Bax/Bcl-2

12、相對水平增加，心肌細胞凋亡增加。在提前給予GR拮抗劑（Ru486,10μM）基礎上再經(jīng)CORT作用，上述變化均可得到相應的改善，提示CORT可能通過GR介導以上心肌細胞結(jié)構(gòu)及凋亡的改變。同時在轉(zhuǎn)染過表達Mfn2后，凋亡蛋白Bax/Bcl-2顯著增加，活化的Caspase3蛋白表達增多以及心肌細胞肥大基因SKA的mRNA水平上升，說明CORT可通過調(diào)控Mfn2表達進而損傷線粒體、促進細胞凋亡，致使心室壁細胞數(shù)目減少，最終引起心臟發(fā)育損傷、