虎杖苷通過激活SIRT3介導(dǎo)的線粒體保護(hù)減輕失血性休克小腸損傷.pdf

1、目的:
　　通過小腸上皮細(xì)胞IEC-6的氧化應(yīng)激模型和大鼠的失血性休克模型探討SIRT3和線粒體在失血性休克小腸損傷中的作用，為PD在失血性休克病人的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。
　　方弦:
　　1.模型與分組
　　1.1 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的確立及分組
　　H2O2的最適刺激條件:96孔板中培養(yǎng)融合度約90％的IEC-6細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0、25、50、100、250、500uM/L) H2O2溶液刺激不同

2、時(shí)間(0、15、30、60、120min)，用CCK8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同條件刺激組細(xì)胞的活性。以刺激后細(xì)胞活性下降20-30％為理想標(biāo)準(zhǔn)，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次以確定氧化應(yīng)激模型的最適H2O2刺激濃度和時(shí)間。
　　PD的最佳保護(hù)濃度:細(xì)胞經(jīng)過不同濃度(0、25、50、100uM/L)的PD處理12小時(shí)，用CCK8試劑盒檢測(cè)不同濃度PD處理組細(xì)胞的活性，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次以確定PD的最佳保護(hù)濃度。
　　細(xì)胞不同處理分組:

3、將生長良好的IEC-6細(xì)胞隨機(jī)分為5組(n=6)。(1)空白對(duì)照組;(2)溶劑預(yù)處理組;(3) PD預(yù)處理組;(4) PD+3-TYP（SIRT3選擇性抑制劑，50uM/L)預(yù)處理組;(5) RSV預(yù)處理組(RSV25uM/L)。預(yù)處理12小時(shí)后，最適條件的H2O2刺激，一定時(shí)間收集不同處理組的細(xì)胞做后續(xù)指標(biāo)的檢測(cè)。
　　1.2 大鼠失血性休克模型的建立及分組
　　實(shí)驗(yàn)符合國際和中國的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法，并由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼

4、養(yǎng)使用委員會(huì)批準(zhǔn)。大鼠的休克模型參照本實(shí)驗(yàn)室既往的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行，即通過股動(dòng)脈放血至30mmHg，維持2小時(shí)后回輸血，繼續(xù)觀察2小時(shí)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為五組(n=14):假手術(shù)對(duì)照組（control組）、溶劑組(vehicle組)、虎杖苷治療組(PD組)，虎杖苷+抑制劑組（PD+3-TYP組）、白藜蘆醇治療組(RSV組)。每組6只大鼠用斷頸法處死以組織提取和線粒體形態(tài)觀察，8只撤去導(dǎo)管，縫合傷口做生存分析。
　　2.檢測(cè)指標(biāo)
　

5、　2.1 虎杖苷對(duì)氧化應(yīng)激損傷小腸上皮細(xì)胞線粒體的影響
　　通過檢測(cè)線粒體跨膜電位（△Ψm）、線粒體通透轉(zhuǎn)變孔(MitochondrialPermeability TransitionPore，mPTP)開放和細(xì)胞內(nèi)ATP含量來評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能影響，以及虎杖苷干預(yù)治療的影響?！鳓穖越低，mPTP開放越多，細(xì)胞ATP含量越低，說明線粒體損傷越嚴(yán)重。
　　2.2 虎杖苷對(duì)氧化應(yīng)激損傷小腸上皮細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響

6、
　　通過流式技術(shù)檢測(cè)DCF熒光評(píng)價(jià)不同處理組細(xì)胞ROS水平，熒光越強(qiáng)，ROS水平越高，說明氧化應(yīng)激損傷越嚴(yán)重。
　　2.3 虎杖苷對(duì)失血性休克大鼠的小腸上皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響
　　收集失血性休克大鼠的小腸組織，制作成超薄組織切片，在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞線粒體的形態(tài)。正常細(xì)胞線粒體呈橢圓形，線粒體基質(zhì)致密，嵴完整、排列整齊且結(jié)構(gòu)正常，而損傷線粒體呈不規(guī)則形，腫脹明顯，嵴排列紊亂或斷裂，輪廓不清，線粒體基質(zhì)透亮，呈

7、空泡狀。通過比較線粒體損傷程度評(píng)價(jià)虎杖苷對(duì)失血性休克腸損傷的干預(yù)作用。
　　2.4 虎杖苷對(duì)失血性休克大鼠小腸組織氧化應(yīng)激水平的影響
　　收集失血性休克大鼠的小腸組織勻漿，使用碧云天檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組的GSH/GSSG比例和丙二醛(MDA)含量來評(píng)價(jià)組織的氧化應(yīng)激水平。GSH/GSSG比例越低，MDA含量越高，說明氧化應(yīng)激水平越高。通過比較氧化應(yīng)激水平來評(píng)價(jià)失血性休克的小腸損傷及虎杖苷的干預(yù)作用。
　　2.5 虎杖苷對(duì)

8、失血性休克大鼠小腸細(xì)胞凋亡和大鼠生存時(shí)間的影響
　　取失血性休克大鼠的小腸制成石蠟包埋的組織切片，使用Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒定位出凋亡的小腸細(xì)胞，然后在顯微鏡下記錄凋亡的細(xì)胞數(shù)目。凋亡細(xì)胞數(shù)越多，小腸損傷越嚴(yán)重。通過比較各組的凋亡細(xì)胞數(shù)，來評(píng)價(jià)失血性休克腸損傷和虎杖苷的干預(yù)作用。
　　失血性休克大鼠撤去導(dǎo)管，縫合傷口，給予足夠的飼料和水，觀察并記錄48h的生存時(shí)間。生存時(shí)間越短，說明失血性休克損傷越嚴(yán)重。通過比較不同治

9、療組的生存時(shí)間來評(píng)價(jià)失血性休克損傷和虎杖苷的干預(yù)作用。
　　2.6 虎杖苷的影響與組織、細(xì)胞內(nèi)SIRT3的蛋白表達(dá)和活性的關(guān)系
　　Western blot技術(shù)檢測(cè)不同處理組SIRT3的蛋白表達(dá)水平;SIRT3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同處理組SIRT3的酶活性。通過比較各組SIRT3的蛋白表達(dá)和酶活性來評(píng)估失血性休克對(duì)小腸SIRT3的影響及虎杖苷的干預(yù)作用。
　　2.7 虎杖苷的影響與組織細(xì)胞內(nèi)SOD2的表達(dá)和活性的關(guān)系<

10、br>　　Western blot技術(shù)檢測(cè)不同處理組SOD2、acetyl-SOD2蛋白表達(dá)水平;SOD2活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同處理組SOD2活性。通過比較各組SOD2、acetyl-SOD2蛋白表達(dá)和SOD2活性來評(píng)估失血性休克對(duì)小腸中SOD2的影響及虎杖苷的干預(yù)作用。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞氧化應(yīng)激模型模型的確立
　　以刺激后細(xì)胞活性下降20-30％為理想標(biāo)準(zhǔn)，H2O2250uM/L，30min被確立為最適刺激條

11、件，此時(shí)的細(xì)胞活性為正常對(duì)照74±2.2％。PD最佳保護(hù)濃度為50uM/L。
　　2.虎杖苷對(duì)氧化應(yīng)激損傷小腸上皮細(xì)胞線粒體的影響
　　與正常對(duì)照組相比，H2O2刺激使小腸上皮細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能受損，線粒體跨膜電位(△Ψm)降低，線粒體通透轉(zhuǎn)變孔(mPTP)開放，細(xì)胞ATP含量降低。虎杖苷或白藜蘆醇預(yù)處理可以減輕線粒體的氧化應(yīng)激損傷，改善△Ψm降低、抑制mPTP開放、促進(jìn)ATP合成，并且二者作用相當(dāng)。使用SIRT3選擇性

12、抑制劑3-TYP可以部分抑制虎杖苷對(duì)氧化應(yīng)激線粒體損傷的保護(hù)作用。
　　3.虎杖苷對(duì)氧化應(yīng)激損傷小腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響
　　與正常對(duì)照組相比，H2O2刺激使小腸上皮細(xì)胞的ROS急劇增加，氧化應(yīng)激水平增高，虎杖苷或白藜蘆醇預(yù)處理可以降低ROS的產(chǎn)生，降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，并且二者作用相當(dāng)。使用3-TYP抑制劑可以部分抑制虎杖苷對(duì)氧化應(yīng)激水平的影響。
　　4.虎杖苷對(duì)失血性休克大鼠的小腸細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響

13、>　　與假手術(shù)對(duì)照組相比，失血性休克大鼠的小腸線粒體形態(tài)明顯受損，呈不規(guī)則形，腫脹明顯，嵴排列紊亂或斷裂，輪廓不清，線粒體基質(zhì)透亮，呈空泡狀，虎杖苷或白藜蘆醇預(yù)處理可以減輕線粒體形態(tài)的改變，甚至接近正常線粒體形態(tài)。使用3-TYP抑制劑可以部分抑制虎杖苷這種線粒體保護(hù)作用。
　　5.虎杖苷對(duì)失血性休克大鼠小腸組織氧化應(yīng)激水平的影響
　　與假手術(shù)對(duì)照組相比，失血性休克大鼠小腸組織的GSH/GSSG比率降低，MDA水平升高，失血性

14、休克造成細(xì)胞過度氧化?；⒄溶栈虬邹继J醇預(yù)處理可以改善GSH/GSSG比率降低和MDA水平升高，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。3-TYP抑制劑可以部分抑制虎杖苷這種抗氧化應(yīng)激作用。
　　6.虎杖苷對(duì)失血性休克大鼠小腸細(xì)胞凋亡和大鼠生存時(shí)間的影響
　　與假手術(shù)對(duì)照組相比，失血性休克大鼠小腸細(xì)胞凋亡增加，大鼠生存時(shí)間短?；⒄溶栈虬邹继J醇預(yù)處理可以減少失血性休克導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，延長大鼠的生存時(shí)間。3-TYP抑制劑可以部分抑制虎杖苷的這種保護(hù)作

15、用。
　　7.虎杖苷的干預(yù)與組織、細(xì)胞內(nèi)SIRT3的蛋白表達(dá)和活性的關(guān)系
　　與對(duì)照相比，模型組SIRT3的蛋白表達(dá)降低，酶活性下降，虎杖苷或白藜蘆醇預(yù)處理可以降低H2O2刺激和失血性休克SIRT3的影響，使蛋白表達(dá)輕微升高，酶活性極大升高。3-TYP抑制劑可以部分抑制虎杖苷對(duì)SIRT3的影響，但未抑制SIRT1的活性和表達(dá)。
　　8.虎杖苷的干預(yù)與組織、細(xì)胞內(nèi)SOD2的表達(dá)和活性的關(guān)系
　　與對(duì)照相比，模型組S

16、OD2表達(dá)降低，acetyl-SOD2表達(dá)增加，導(dǎo)致SOD2酶活性下降，虎杖苷或白藜蘆醇預(yù)處理可以降低H2O2刺激和失血性休克對(duì)SOD2的影響，使SOD2表達(dá)輕微增加，acetyl-SOD2表達(dá)極大降低，SOD2酶活性升高。3-TYP抑制劑可以部分抑制虎杖苷對(duì)SOD2的影響。
　　結(jié)論:
　　1.重癥失血性休克小腸細(xì)胞發(fā)生了線粒體損傷。
　　2.虎杖苷減輕重癥失血性休克小腸損傷，延長休克大鼠生存時(shí)間。
　　3.虎