虎杖甙對(duì)產(chǎn)兔失血性休克后肺損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、產(chǎn)后出血是我國(guó)乃至全球孕產(chǎn)婦死亡的主要因?yàn)?每年估計(jì)約有14萬(wàn)婦女死于產(chǎn)后出血。全球超過(guò)一半的孕產(chǎn)婦死亡發(fā)生在產(chǎn)后24小時(shí)內(nèi),死因?yàn)槌鲅^(guò)多。產(chǎn)后出血除導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡外,還可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥,如急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)、凝血系統(tǒng)疾病和席漢氏綜合癥。休克和ARDS是圍產(chǎn)期婦女入住重癥監(jiān)護(hù)中心(Intensive Care Unit,ICU)的主要因?yàn)?分別占產(chǎn)科

2、ICU所有疾病的25％和19％。近年研究發(fā)現(xiàn),輸血作為失血性休克后的治療措施之一,本身也可以引起急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)即輸血相關(guān)性急性肺損傷。失血性休克后的ALI,病情發(fā)展迅速,容易進(jìn)一步惡化發(fā)展為ARDS,繼而進(jìn)展為多器官功能障礙綜合征,導(dǎo)致圍產(chǎn)期婦女死亡。如果能夠在糾正產(chǎn)后失血性休克的同時(shí)進(jìn)行有效地器官保護(hù),防止ARDS的發(fā)生,無(wú)疑將顯著改善患者的預(yù)后,降低孕產(chǎn)婦死亡率。
　　 ALI/AR

3、DS是在嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等非心源性疾病過(guò)程中,肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫,導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。目前普遍認(rèn)為肺組織缺血.再灌注損傷、炎性細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)作用、腸道細(xì)菌/內(nèi)毒素移位是導(dǎo)致失血性休克后ALI的根本因?yàn)?但其確切的發(fā)病機(jī)制仍有待深入闡明。
　　 肺是失血性休克后缺血再灌注損傷最嚴(yán)重的器官,也是失血性休克后急性肺損傷的重要途徑。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物,可以

4、通過(guò)MDA含量的檢測(cè)反映缺血再灌注時(shí)體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生水平,間接了解組織缺血再灌注損傷程度。促炎因子(TNF-α,IL-1,IL-6等)的過(guò)度釋放與抑炎因子(IL-4、IL-10)的相對(duì)表達(dá)不足,導(dǎo)致促炎/抗炎的失衡在ALI/ARDS的發(fā)病過(guò)程起重要作用。
　　 虎杖甙(Polydatin,PD),又名白藜蘆醇甙,是從虎杖的根莖中提取的第4種單體,化學(xué)結(jié)構(gòu)已確定為3,4’,5-三羥基3-單-D-葡糖甙。主要功效有祛風(fēng)利濕,祛痰止

5、咳,清熱解毒,活血化瘀。中醫(yī)臨床用于治療肺熱咳嗽,濕熱黃疸,瘡癰腫毒,關(guān)節(jié)痹痛,經(jīng)閉經(jīng)痛,水火燙傷,跌打損傷等。趙克森等通過(guò)大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,虎杖甙能明顯提高失血性休克和燒傷性休克動(dòng)物的存活率,改善微循環(huán),減少白細(xì)胞貼壁黏著,還有增加心功能和增加脈壓的效應(yīng)。2006年虎杖甙通過(guò)了國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的評(píng)審,取得了臨床試驗(yàn)的正式批件,成為我國(guó)為數(shù)不多的Ⅰ類(lèi)新藥的臨床試驗(yàn)批件,應(yīng)用于失血性休克和燒傷性休克的臨床研究。目前已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表

6、明,虎杖甙通過(guò)降低促炎因子的釋放,抑制肺組織磷脂酶A2的活性,減輕內(nèi)毒性休克后的肺損傷,但未見(jiàn)虎杖甙對(duì)失血性休克后肺損傷的研究報(bào)道。
　　 基于孕產(chǎn)婦血容量高、血液高凝、肺功能殘氣量及氧合功能的降低,產(chǎn)后出血導(dǎo)致的失血性休克與非妊娠期失血性休克后的急性肺損傷可能有不同之處。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在出血未控制條件下,限制性輸液聯(lián)合應(yīng)用虎杖甙復(fù)蘇孕兔失血性休克較單純應(yīng)用限制性輸液能改善微循環(huán),延長(zhǎng)動(dòng)物生存時(shí)間,我們推測(cè)此藥物能改善產(chǎn)兔失血

7、性休克后的肺損傷的嚴(yán)重程度。
　　 [目的]
　　 1 建立產(chǎn)兔失血性休克后急性肺損傷模型,通過(guò)研究缺血-再灌注損傷、NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),多性核中性粒細(xì)胞的活化,探討產(chǎn)兔失血性休克后急性肺損傷的發(fā)生機(jī)制。
　　 2 證實(shí)虎杖甙對(duì)產(chǎn)兔休克后急性肺損傷的保護(hù)作用,通過(guò)研究熱休克蛋白,NF-κB,ICAM-1等,闡明虎杖甙對(duì)休克后急性肺損傷保護(hù)作用的的分子機(jī)制。
　　 3 探討虎杖甙對(duì)產(chǎn)兔休克后肝腎功能的

8、影響,評(píng)價(jià)藥物應(yīng)用于產(chǎn)兔休克后的安全性,為日后應(yīng)用于臨床研究提供理論依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 40只孕晚期新西蘭白兔,年齡2-2.5歲,妊娠年齡25-30天,產(chǎn)后6小時(shí)建立動(dòng)物失血性休克模型。
　　 2、建立產(chǎn)兔失血性休克模型
　　 經(jīng)過(guò)麻醉動(dòng)物、備皮、股動(dòng)靜脈插管,操作完畢后15分鐘后,連續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(Mean arterial pressure,MAP),記錄基礎(chǔ)期

9、指標(biāo)。模型分為2期。①休克期(T0～T60min):動(dòng)物自股動(dòng)脈放血開(kāi)始時(shí)間為T(mén)0,右側(cè)股動(dòng)脈放血,速度2ml/kg/min,約15分鐘MAP降至40-45minHg,維持45分鐘,放出的血液經(jīng)肝素化處理以備回輸。②復(fù)蘇期(T60～T360min):股動(dòng)脈放血后第60min(T60),生理鹽水與虎杖甙組分別輸入4ml/Kg生理鹽水與虎杖甙(1mg/ml),20分鐘后回輸自身血(股動(dòng)脈失血量的一半)。T360停止實(shí)驗(yàn)。拔除動(dòng)物各管道,縫合

10、股動(dòng)靜脈,縫合皮膚,放回籠內(nèi),自由飲水、進(jìn)食,記錄動(dòng)物存活時(shí)間。ALI診斷標(biāo)準(zhǔn)為PaO2/FiO2<300 mmHg。
　　 3、實(shí)驗(yàn)分組
　　 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào),隨機(jī)分為4組,每組10只。①假休克組(Sham shock group:SS):動(dòng)物僅接受麻醉、插管監(jiān)測(cè)血壓,未接受休克及復(fù)蘇處理；②休克組(Shockgroup:SH):動(dòng)物接受麻醉、插管、休克處理,未予任何復(fù)蘇； ③生理鹽水組(Normal saline g

11、roup,NS):T60,靜脈注射生理鹽水4ml/Kg,20分鐘后回輸自身血(股動(dòng)脈失血量的一半)；④虎杖甙組(Polydatin group,PD):T60,靜脈注射4ml/kg虎杖甙(1mg/ml),20分鐘后回輸自身血(股動(dòng)脈失血量的一半)。
　　 4、監(jiān)測(cè)指標(biāo)
　　 4.1持續(xù)監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo):MAP
　　 4.2分別于T0(基礎(chǔ)期)、T60(放血后60min)、T80(給藥后20min)、T360(輸

12、血后280min)取股動(dòng)脈血檢測(cè)紅細(xì)胞比容(hematocrit,Hct)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、肌酐(Creatinine,Cr)、PaO2、PaCO2、PaO2/FiO2、pH、乳酸、腫瘤壞死因子-alpha(TNF-α),白介素-10(IL-10)。Hct的測(cè)定采用微量血液離心機(jī)(金壇市正基儀器有限公司),ALT、Cr采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。PaO2、PaCO2、pH的檢測(cè)采用全自

13、動(dòng)血?dú)夥治鰞x(Medica Easy Blood GasAnalyzer,Medica Corporaton,U.S.A.)。乳酸試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。TNF-α、IL-10檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)。TNF-α,IL-10試劑盒購(gòu)于(R&D Systems,Minneapolis,MN；Biosource International,Camarillo,CA),空氣中氧含量為21％,定義FiO2=21％,計(jì)算P

14、aO2/FiO2。
　　 4.3肺組織檢測(cè):SH組在休克后2-3h死亡,立即取肺組織。其余3組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)6h過(guò)程中均存活,于T360min,每組隨機(jī)取3只動(dòng)物行安樂(lè)死,注射過(guò)量戊巴比妥鈉,取肺組織。具體如下:左肺下葉組織福爾馬林固定、石蠟包埋、切片、HE染色。光鏡下觀察肺間質(zhì)水腫及白細(xì)胞浸潤(rùn)程度。左肺上葉-80℃凍存,行肺組織髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性,丙二醛(Malondialdehyde,MD

15、A)含量,細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)mRNA與熱休克蛋白70[Heat Shock Protein(HSP)-70]的表達(dá)、NF-κB的表達(dá)及其結(jié)合力的檢測(cè),右肺行濕,干質(zhì)量比(Wet/dry Weight,WW/DW)檢測(cè)。MPO、MDA試劑盒分別購(gòu)于南京建成生物工程研究所。ICAM-1 mRNA的檢測(cè)采用TRIzol法提取總RNA,SYBR Green I實(shí)

16、時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR。Trizol試劑盒[美國(guó)MolecularResearch Center(MRC)公司],第一鏈cDNA合成試劑盒以及熒光定量試劑盒(RevertAidaTM First Strand cDNA Synthesis Kit,MaximTM SYBR Green/ROXqPCR Master Mix 2×,Fermentas)。肺組織HSP-70、NF-κB的表達(dá)采用WesternBlot方法,內(nèi)對(duì)照選擇β-actin

17、。肺組織HSP-70單克隆抗體(SPA-antibody,Stressgen Bioreagents Co,Ann Arbor,MI),NF-κB p65(NeoMarkers,Thermo FisherScientific,Fremont,CA,USA),β-actin(NeoMarkers,Thermo Fisher Scientific,Fremont,CA,USA)。NF-κB結(jié)合力檢測(cè)采用ELISA方法。NF-κB結(jié)合力購(gòu)于(

18、Cayman Chemical Company,Ann Arbor,MI)。
　　 4.4肝腎組織行病理切片,HE染色
　　 4.5統(tǒng)計(jì)出血量及輸血量
　　 4.6產(chǎn)兔生存時(shí)間。
　　 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 [結(jié)論]
　　 虎杖甙對(duì)產(chǎn)兔失血性復(fù)蘇后的肺損傷存在保護(hù)作用,可能與其減輕缺血再灌注損傷,增強(qiáng)肺組織HSP-70的表達(dá),從而抑制肺組織NF-κB的激活,降低血清TNF-α的釋放以及肺組