利福平抑制魚藤酮介導(dǎo)的線粒體損傷作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一．研究背景: 帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一，其病理為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性及死亡，并伴有殘存神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)路易氏小體。大量證據(jù)表明，凋亡是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡的主要機(jī)制，而且線粒體氧化應(yīng)激是凋亡的關(guān)鍵。 魚藤酮作為線粒體復(fù)合物Ⅰ抑制劑，能夠增加活性氧的生成及細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的消耗，導(dǎo)致氧化損傷，進(jìn)而增加線粒體通透性，引起線粒體膜電位的去極化，誘導(dǎo)凋亡。分化

2、PC12細(xì)胞具有典型的多巴胺能特征。因此，魚藤酮誘導(dǎo)的分化PC12細(xì)胞模型可作為研究PD線粒體氧化應(yīng)激機(jī)制的很好模型。 PD仍是以內(nèi)科治療為主，盡管許多藥物如左旋多巴能有效緩解PD癥狀，但是長(zhǎng)期使用這些藥物常常會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重副作用，這些藥物無(wú)法阻止疾病的進(jìn)展。因此，很有必要尋找有效且副作用少，能阻止或逆轉(zhuǎn)該疾病的藥物。利福平作為利福霉素的半合成衍生物，臨床應(yīng)用已有40余年歷史，具有良好的安全性，研究表明其除有殺菌作用外，尚具抗凋亡

3、和神經(jīng)保護(hù)作用。我們的前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一神經(jīng)保護(hù)作用。然而，利福平介導(dǎo)這一作用的具體機(jī)制尚不明確。有研究表明，利福平可能作為自由基清除劑起神經(jīng)保護(hù)作用。且迄今為止，尚未見(jiàn)體外魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞模型上研究線粒體氧化應(yīng)激與利福平神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)性的報(bào)道。 基于上述的理論基礎(chǔ)和研究背景，本研究選擇魚藤酮誘導(dǎo)分化PC12細(xì)胞構(gòu)建線粒體氧化應(yīng)激的PD細(xì)胞模型，進(jìn)一步探討和研究利福平神經(jīng)保護(hù)和抗細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。 二．研究目的:

4、 1．魚藤酮誘導(dǎo)分化PC12細(xì)胞構(gòu)建線粒體氧化應(yīng)激的PD細(xì)胞模型。 2．探討利福平對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位、活性氧及谷胱甘肽的影響。 3．明確利福平對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型的保護(hù)作用。 4．探討利福平的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為其用于PD的臨床治療提供依據(jù)。 三．實(shí)驗(yàn)對(duì)象和方法: 1．細(xì)胞培養(yǎng)及分組：PC12細(xì)胞（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株細(xì)胞）經(jīng)100ng/ml7S神經(jīng)生長(zhǎng)因子處理9天成

5、分化細(xì)胞后培養(yǎng)于含有10％胎牛血清的DMEM/F12中，并孵育在含5％ CO2的37℃培養(yǎng)箱中。隔天更換培養(yǎng)基。根據(jù)不同的處理?xiàng)l件分成六組：對(duì)照組（常規(guī)加培養(yǎng)基）、利福平組（300μmol/L利福平作用26h）、魚藤酮組（2．5μmol/L魚藤酮作用24h）和三組利福平預(yù)處理組（先分別給予100，200 and300μmol/L利福平預(yù)處理2h，然后2．5μmol/L魚藤酮再作用24h）。 2．檢測(cè)方法：（1） MTT法檢測(cè)細(xì)胞

6、活性；（2） Hoechst33342核染和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；（3）熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀測(cè)量經(jīng)羅丹明123標(biāo)記的線粒體膜電位；（4）流式細(xì)胞儀分析DCFH—DA標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)活性氧生成；（5）酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽。 3．統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析，處理組間的兩兩比較用LSD—t檢驗(yàn)，P<0．05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 四．實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 2．5μmo

7、l/L魚藤酮作用24h能增加分化PC12細(xì)胞凋亡同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞線粒體膜電位去極化、增加活性氧生成及谷胱甘肽耗竭；當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)100，200 and300μmol/L利福平預(yù)處理2h后，魚藤酮誘導(dǎo)的這一線粒體功能障礙能夠被利福平以劑量依賴的方式阻斷。 五．實(shí)驗(yàn)結(jié)論: 1．利福平能降低魚藤酮誘導(dǎo)的分化PC12細(xì)胞線粒體膜電位去極化、活性氧含量生成及還原型谷胱甘肽的消耗。 2．利福平能抑制魚藤酮誘導(dǎo)的分化PC12細(xì)胞凋亡。