丁基苯酞對(duì)魚藤酮帕金森病模型保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討丁基苯酞（dl-3-n-Butylphthalide，NBP）對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞和動(dòng)物模型的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。
　　 方法：（1）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：分別使用終濃度為0.1 μM、1 μM、10 μM、100 μM NBP和溶劑二甲基亞砜（DMSO）預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，加入終濃度為200 nM的魚藤酮處理24 h建立多巴胺能細(xì)胞損傷模型。觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測細(xì)胞

2、活性，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡與壞死（Hoechst33342/PI），流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率（Annexin V-FITC/PI）、線粒體膜電位（JC-1）、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平（DCFH-DA）；（2）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：Sprague-Dawley大鼠單側(cè)黑質(zhì)致密部（SNc）和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）兩點(diǎn)立體定向注射魚藤酮制備帕金森病大鼠模型，隨機(jī)分組后，治療組采用NBP 80mg/kg/d連續(xù)灌胃給藥14 d。計(jì)數(shù)30 min內(nèi)阿撲嗎啡（A

3、PO）誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)；分光光度計(jì)測定中腦丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力；免疫組織化學(xué)染色測定黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（TH）及神經(jīng)細(xì)胞核（NeuN）雙重陽性細(xì)胞數(shù)量；（3）機(jī)制研究：在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤多巴胺能的四種不同細(xì)胞系（SH-SY5Y細(xì)胞株、IMR-32細(xì)胞株、SK-N-AS細(xì)胞株及BE（2）-M17細(xì)胞株）中，100 μM NBP和DMSO分別加入上述培養(yǎng)的四種細(xì)胞系中作用24 h，免疫熒光染色測定α-突觸核蛋白（SN

4、CA）表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SNCA以及囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（VMAT2） mRNA表達(dá)；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，隨機(jī)分組后，各組分別在處死前18 h和6 h腹腔注射NBP（80 mg/kg，NBP:DMSO:PBS=1:2:17）或溶劑（DMSO:H2O=3:17），免疫熒光染色測定VMAT2或SNCA表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SNCA以及VMAT2 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：200 nM魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h能夠誘導(dǎo)

5、細(xì)胞活性下降和細(xì)胞凋亡。NBP預(yù)處理后，SH-SY5Y細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，線粒體膜電位顯著升高（P<0.05），細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯降低（P<0.05），在一定濃度范圍內(nèi)，隨著NBP濃度的增加對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用增強(qiáng)。使用NBP治療魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病大鼠模型兩周，可明顯改善PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為（降低48％，與魚藤酮組相比，P<0.05），提高黑質(zhì)DA神經(jīng)元的存活率（增加30％，與魚藤酮組相比，P<0.05）以

6、及紋狀體DA神經(jīng)元的數(shù)目（增加49％，與魚藤酮組相比，P<0.05）。另外，在大鼠黑質(zhì)致密部及四種細(xì)胞系中，NBP組與溶劑對(duì)照組相比，SNCA蛋白的表達(dá)量無顯著性差異（P>0.05），VMAT2蛋白表達(dá)量增加了63.76％；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，NBP組在SH-SY5Y細(xì)胞和IMR-32細(xì)胞中VMAT2 mRNA表達(dá)量分別增加了16.32％、39.39％；而在SK-N-AS細(xì)胞及BE（2）-M17細(xì)胞中NB

7、P對(duì)VMAT2 mRNA表達(dá)并無明顯影響。與溶劑對(duì)照組相比，NBP組在大鼠中腦黑質(zhì)致密部中VMAT2 mRNA表達(dá)量上調(diào)了38.35％（以GAPDH作內(nèi)參）和80.76％（以β-actin作內(nèi)參），而SNCA mRNA表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：NBP可明顯緩解魚藤酮在PD細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中誘導(dǎo)的損傷，可能通過抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡、線粒體保護(hù)、抗自由基損傷、上調(diào)PD保護(hù)性基因VMAT2表達(dá)等機(jī)制實(shí)現(xiàn)，研究還發(fā)現(xiàn)NBP并不引