高遷移率族蛋白在魚藤酮誘導帕金森病模型中對α-synuclein聚集的調(diào)控作用及其機制研究.pdf

1、目的：在魚藤酮（Rotenone，Rot）誘導的帕金森病細胞模型中，探討高遷移率族蛋白(High mobility group box1，HMGB1)對α-synuclein（α-syn）聚集的調(diào)節(jié)機制。
　　方法：魚藤酮處理體外培養(yǎng)的人神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）細胞株建立帕金森病細胞模型。免疫熒光法觀察Rot誘導下HMGB1的細胞內(nèi)定位，并用蛋白免疫印跡法及RT-PCR技術觀察不同濃度和作用時間的Rot處理后，細胞內(nèi)α-

2、syn表達量與HMGB1的關系；應用免疫共沉淀法檢測α-syn與HMGB1之間的相互作用。進一步轉染過表達HMGB1質(zhì)粒及siRNA-HMGB1質(zhì)粒到SH-SY5Y細胞中，用電鏡觀察HMGB1的表達變化對細胞自噬的影響；同時應用免疫印跡和免疫共沉淀技術探究細胞內(nèi)HMGB1對自噬相關蛋白LC3、P62、Beclin1及其復合體表達的影響。
　　結果：SH-SY5Y細胞在魚藤酮（1μmol/L）作用下穩(wěn)定表達α-syn，成功建立PD細

3、胞模型。Rot能夠誘導細胞內(nèi)HMGB1從細胞核向細胞漿轉移，伴隨固定濃度Rot（1μM）作用時間的延長（0、12h、24h、48h），細胞內(nèi)α-syn聚集明顯增多，細胞內(nèi)HMGB1含量也隨之升高，各時間點差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；不同濃度梯度的Rot（0、0.4μM、0.8μM、1μM、2μM）培養(yǎng)24h后，在1μM濃度作用范圍內(nèi)，細胞內(nèi)HMGB1與α-syn呈濃度依賴型增長，各濃度組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在2μM

4、Rot作用24h后，α-syn仍保持較高水平，而HMGB1含量下降。免疫共沉淀提示HMGB1與α-syn在Rot誘導下形成復合體。在Rot作用下，細胞內(nèi)過表達HMGB1提高了LC3Ⅱ、P62的表達量，并在電鏡下觀察到自噬體增多、細胞器結構紊亂；而降低細胞內(nèi)HMGB1的表達，LC3Ⅱ/I比值有所恢復、P62含量也降低。過表達的HMGB1在細胞損傷情況下抑制Beclin1表達，并可以介導Beclin1與Bcl-2的結合，導致Beclin1-