Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在棕櫚酸鈉誘導(dǎo)下腎小管損傷中的作用.pdf

1、目的：探討脂肪酸介導(dǎo)的腎小管損傷的潛在機(jī)制——Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬。
　　方法：（1）人體實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組：早期慢性腎臟病合并高脂血癥患者腎臟標(biāo)本。病理類型：膜性腎病、IgA腎病。對照組：因外傷手術(shù)需切除部分腎臟（無基礎(chǔ)腎臟疾病及不伴高脂血癥）的患者腎臟組織。腎臟組織中Parkin、Beclin1及LC3蛋白表達(dá)水平采用免疫組化和免疫熒光染色方法。（2）動物實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分配20只雄性SD大鼠為兩組：正常對照組（n=10），普通飼料喂

2、養(yǎng)；高脂組（n=10），高脂飼料喂養(yǎng)。12周后檢測血清膽固醇、甘油三酯水平。采用免疫組化、免疫熒光及Western blot技術(shù)檢測Parkin、LC3II/I、Beclin1等蛋白表達(dá)。（3）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞（ human proximal tubular epithelial cell line，HK-2），采用慢病毒GFP-LC3（MOI=60）轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，使HK-2細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3，用棕櫚酸鈉（

3、一種飽和的脂肪酸）刺激HK-2，采用Western blot及細(xì)胞免疫熒光技術(shù)來檢測Parkin、Beclin1及LC3在HK-2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；采用MDC檢測細(xì)胞內(nèi)酸性液泡；采用DCFH-DA染色檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平；JC-1技術(shù)用于檢測HK-2細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位；采用線粒體示蹤劑(Mitochondria tracer)檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)；采用TUNEL檢測凋亡水平。轉(zhuǎn)染si-Parkin敲低HK-2細(xì)胞內(nèi)Parkin表達(dá)，觀察PA

4、處理下HK-2細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位，慢病毒GFP-LC3與線粒體共定位以及細(xì)胞凋亡水平。采用氧自由基清除劑Tempol預(yù)處理HK-2，檢測棕櫚酸鈉處理組或未處理組細(xì)胞內(nèi)凋亡水平。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件處理，兩組資料比較采用t檢驗(yàn)，多組資料比較采用單因素方差分析，P值＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：（1）早期慢性腎臟病合并高脂血癥（Chronic kidney disease, C

5、KD）患者腎臟Parkin、Beclin1及LC3蛋白表達(dá)較因外傷無腎臟基礎(chǔ)疾病無高脂血癥的對照組患者腎臟中表達(dá)明顯增高。（2）高脂喂養(yǎng)組大鼠腎臟Parkin、Beclin1及LC3的表達(dá)較正常飲食組明顯增高（p＜0.05）。（3）高脂喂養(yǎng)組血清膽固醇、甘油三酯表達(dá)水平較正常飲食組明顯增加（p＜0.05）。（4）PA誘導(dǎo)下HK-2細(xì)胞內(nèi)Parkin、Beclin1及LC3的表達(dá)呈劑量依賴性增加, MDC水平、ROS及細(xì)胞凋亡較對照組明顯

6、增加，線粒體膜電位下降，GFP-LC3和Parkin的共定位增加, GFP-LC3和線粒體共定位增加，線粒體和Parkin的共定位增加。（5）敲低Parkin表達(dá)水平, PA誘導(dǎo)下HK-2細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3與線粒體共定位、線粒體膜電位較未敲低組減少，ROS水平及細(xì)胞凋亡較siParkin未轉(zhuǎn)染組明顯增加。（6）采用氧自由基清除劑Tempol抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的堆積，能緩解棕櫚酸鈉誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：線粒體自噬通過