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文檔簡介
1、目的:探討脂肪酸介導(dǎo)的腎小管損傷的潛在機(jī)制——Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬。
方法:(1)人體實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組:早期慢性腎臟病合并高脂血癥患者腎臟標(biāo)本。病理類型:膜性腎病、IgA腎病。對照組:因外傷手術(shù)需切除部分腎臟(無基礎(chǔ)腎臟疾病及不伴高脂血癥)的患者腎臟組織。腎臟組織中Parkin、Beclin1及LC3蛋白表達(dá)水平采用免疫組化和免疫熒光染色方法。(2)動物實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分配20只雄性SD大鼠為兩組:正常對照組(n=10),普通飼料喂
2、養(yǎng);高脂組(n=10),高脂飼料喂養(yǎng)。12周后檢測血清膽固醇、甘油三酯水平。采用免疫組化、免疫熒光及Western blot技術(shù)檢測Parkin、LC3II/I、Beclin1等蛋白表達(dá)。(3)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞( human proximal tubular epithelial cell line,HK-2),采用慢病毒GFP-LC3(MOI=60)轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞,使HK-2細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3,用棕櫚酸鈉(
3、一種飽和的脂肪酸)刺激HK-2,采用Western blot及細(xì)胞免疫熒光技術(shù)來檢測Parkin、Beclin1及LC3在HK-2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá);采用MDC檢測細(xì)胞內(nèi)酸性液泡;采用DCFH-DA染色檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平;JC-1技術(shù)用于檢測HK-2細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位;采用線粒體示蹤劑(Mitochondria tracer)檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài);采用TUNEL檢測凋亡水平。轉(zhuǎn)染si-Parkin敲低HK-2細(xì)胞內(nèi)Parkin表達(dá),觀察PA
4、處理下HK-2細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位,慢病毒GFP-LC3與線粒體共定位以及細(xì)胞凋亡水平。采用氧自由基清除劑Tempol預(yù)處理HK-2,檢測棕櫚酸鈉處理組或未處理組細(xì)胞內(nèi)凋亡水平。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件處理,兩組資料比較采用t檢驗(yàn),多組資料比較采用單因素方差分析,P值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:(1)早期慢性腎臟病合并高脂血癥(Chronic kidney disease, C
5、KD)患者腎臟Parkin、Beclin1及LC3蛋白表達(dá)較因外傷無腎臟基礎(chǔ)疾病無高脂血癥的對照組患者腎臟中表達(dá)明顯增高。(2)高脂喂養(yǎng)組大鼠腎臟Parkin、Beclin1及LC3的表達(dá)較正常飲食組明顯增高(p<0.05)。(3)高脂喂養(yǎng)組血清膽固醇、甘油三酯表達(dá)水平較正常飲食組明顯增加(p<0.05)。(4)PA誘導(dǎo)下HK-2細(xì)胞內(nèi)Parkin、Beclin1及LC3的表達(dá)呈劑量依賴性增加, MDC水平、ROS及細(xì)胞凋亡較對照組明顯
6、增加,線粒體膜電位下降,GFP-LC3和Parkin的共定位增加, GFP-LC3和線粒體共定位增加,線粒體和Parkin的共定位增加。(5)敲低Parkin表達(dá)水平, PA誘導(dǎo)下HK-2細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3與線粒體共定位、線粒體膜電位較未敲低組減少,ROS水平及細(xì)胞凋亡較siParkin未轉(zhuǎn)染組明顯增加。(6)采用氧自由基清除劑Tempol抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的堆積,能緩解棕櫚酸鈉誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的凋亡。
結(jié)論:線粒體自噬通過
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