廣西巴馬小型豬T2DM相關(guān)miRNAs表達(dá)差異及調(diào)控機(jī)制初步研究.pdf

1、糖尿病是人類三大慢性疾病之一，以Ⅱ型糖尿病居多。Ⅱ型糖尿病主要是由于機(jī)體的胰島素抵抗作用進(jìn)而導(dǎo)致全身能量代謝紊亂的疾病，患者在患病后期會(huì)出現(xiàn)糖尿病腎病、心臟病等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，小分子miRNAs能夠參與Ⅱ型糖尿病的調(diào)控。本研究的目的是測(cè)定廣西巴馬小型豬miRNAs的組織表達(dá)譜;對(duì)廣西巴馬小型豬Ⅱ型糖尿病模型不同組織miRNAs的表達(dá)差異進(jìn)行分析;探討miR-103/107在體外和體內(nèi)對(duì)Ⅱ型糖尿病的調(diào)控機(jī)制，為人

2、類糖尿病的研究、治療提供新的靶點(diǎn)。
　　參照miRBase公布的miR-103、107、122、143-5p基因序列，設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物，克隆廣西巴馬小型豬miR-103、107、122、143-5p基因的成熟序列。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定巴馬小型豬miRNAs的組織表達(dá)譜。結(jié)果顯示巴馬小型豬miR-103、107、122、143-5p與miRBase公布的豬、人類、小鼠、綿羊、雞等物種序列一致，未出現(xiàn)堿基突變;miR-122

3、在肝臟組織中特異性的表達(dá)，且表達(dá)量顯著高于其他miRNAs(P＜0.05);miR-103、107、143-5p在肝臟、骨骼肌、脂肪組織中均有表達(dá)，且miR-103在骨骼肌和脂肪組織中的表達(dá)量顯著高于miR-143-5p和miR-122(P＜0.05)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測(cè)定T2DM模型發(fā)病組、未發(fā)病以及對(duì)照組的肝臟、骨骼肌、脂肪組織中miR-103、107、122的表達(dá)水平，結(jié)果顯示發(fā)病組肝臟組織中miR-122的表達(dá)量上調(diào)

4、，miR-103/107在發(fā)病組三個(gè)組織中的表達(dá)量均上調(diào)。因此篩選miR-103/107進(jìn)行后續(xù)研究。
　　利用miRDanda、Targetscan網(wǎng)站以及文獻(xiàn)報(bào)道預(yù)測(cè)miR-103/107能夠與人和小鼠Caveolin-1基因的3'UTR區(qū)結(jié)合，存在三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，與NCBI公布的豬Caveolin-1基因序列進(jìn)行比對(duì)，豬Caveolin-1基因3'UTR區(qū)存在一個(gè)miR-103/107結(jié)合位點(diǎn)。本試驗(yàn)克隆巴馬小型豬Caveol

5、in-1基因包含3'UTR區(qū)域的1885 bp基因序列，與GenBank中公布的豬Caveolin-1基因3'UTR序列比對(duì)，結(jié)果顯示巴馬小型豬Caveolin-1基因3'UTR存在8處堿基突變，1處堿基缺失，1處堿基插入，同源性為99.6％，巴馬小型豬Caveolin-1基因3'UTR序列在1658-1715 bp存在一處miR-103/107的結(jié)合位點(diǎn)。本試驗(yàn)構(gòu)建pEGFP-C1-pre-103、pcDNA3.1(+)-EGFP-p

6、re-103、pEGFP-C1-pre-107、pcDNA3.1(+)-EGFP-pre-107真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞C2C12，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-103/107、Caveolin-1基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示C2C12細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-pre-103、pcDNA3.1(+)-EGFP-pre-103真核表達(dá)載體后miR-103的表達(dá)量上調(diào)，C2C12細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-pre-107、pcD

7、NA3.1(+)-EGFP-pre-107真核表達(dá)載體后miR-107的表達(dá)量上調(diào);在C2C12細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-103/107后，Caveolin-1基因的表達(dá)量均下調(diào)。結(jié)果表明，在體外過(guò)表達(dá)miR-103/107能夠直接抑制靶基因Caveolin-1的表達(dá)水平。
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定巴馬小型豬T2DM模型肝臟、骨骼肌、脂肪組織中Caveolin-1的表達(dá)水平。結(jié)果表明，巴馬小型豬發(fā)病組Caveolin-1在三個(gè)組織

8、中的表達(dá)量均下調(diào)。對(duì)巴馬小型豬T2DM模型中發(fā)病組和未發(fā)病組Caveolin-1基因與miR-103/107的結(jié)合區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，結(jié)果顯示在Caveolin-1基因與miR-103/107結(jié)合區(qū)域的1683 bp位點(diǎn)存在A/T突變，發(fā)病組有AA基因型豬3頭、AT基因型豬3頭，未發(fā)病組AT基因型豬1頭、TT基因型豬2頭。
　　綜上所述，巴馬小型豬T2DM模型發(fā)病組肝臟組織miR-122表達(dá)量上調(diào);miR-103/107在發(fā)