廣西巴馬小型豬動(dòng)脈病變與ABCA1關(guān)系的初步研究.pdf

1、大動(dòng)脈因血流速度快、血壓大等原因易出現(xiàn)內(nèi)皮損傷。膽固醇代謝物質(zhì)易粘附于損傷的血管內(nèi)膜形成脂質(zhì)沉積，血管發(fā)生堵塞及血栓形成，進(jìn)而發(fā)展成為動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。膽固醇代謝異常是動(dòng)脈粥樣病變的主要原因。膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的限速蛋白ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ABCA1)對(duì)膽固醇代謝尤為重要。ABCA1與動(dòng)脈病變之間的作用及調(diào)控關(guān)系復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種microRNA參與對(duì)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)及動(dòng)脈粥樣硬化的調(diào)控。
　　本實(shí)

2、驗(yàn)采用廣西巴馬小型豬為實(shí)驗(yàn)材料，選取常規(guī)飼養(yǎng)豬4頭，飼以常規(guī)飼料作為對(duì)照組;選取高脂高糖飼喂豬，9頭飼以高脂高糖飼料作為實(shí)驗(yàn)1組，5頭飼以高脂高糖高膽固醇作為實(shí)驗(yàn)2組。實(shí)驗(yàn)為期3個(gè)月，其間每月檢測(cè)血液生理生化指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)檢測(cè)動(dòng)脈病理變化情況?？寺V西巴馬小型豬ABCA1基因CDs并分析其生物學(xué)信息。檢測(cè)ABCA1 mRNA及蛋白在各組實(shí)驗(yàn)豬主動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈中的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)以ABCA1為靶基因的miRNA-33a、miR

3、NA-758在各組實(shí)驗(yàn)豬肝臟中的表達(dá)情況。構(gòu)建ABCA1真核表達(dá)載體并驗(yàn)證其功能。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)來(lái)探討動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中ABCA1與膽固醇代謝的變化及影響ABCA1表達(dá)的microRNAs的變化情況，并為制作轉(zhuǎn)ABCA1廣西巴馬小型豬奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:
　　(1)實(shí)驗(yàn)2組血清總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平均呈上升趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)1組與對(duì)照組血清總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平無(wú)明顯差異。
　　(2)主動(dòng)脈、頸

4、動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈制作病理切片HE染色檢驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組各動(dòng)脈均出現(xiàn)不同程度病變。實(shí)驗(yàn)1組各動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂。實(shí)驗(yàn)2組各動(dòng)脈病變較實(shí)驗(yàn)1組嚴(yán)重，內(nèi)膜不平整，中膜增厚并出現(xiàn)巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞。
　　(3)實(shí)驗(yàn)獲得的廣西巴馬小型豬ABCA1 CDs全長(zhǎng)2856bp，編碼961個(gè)氨基酸，成熟蛋白無(wú)信號(hào)肽，ATP轉(zhuǎn)運(yùn)體活性中心位于第602-834位氨基酸。
　　(4)qRT-PCR結(jié)果顯示:在主動(dòng)脈和頸

5、動(dòng)脈，實(shí)驗(yàn)2組ABCA1 mRNA表達(dá)量顯著高于實(shí)驗(yàn)1組和對(duì)照組(P＜0.05);在腹主動(dòng)脈，實(shí)驗(yàn)2組和實(shí)驗(yàn)1組ABCA1 mRNA表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。免疫組化半定量分析結(jié)果顯示:在主動(dòng)脈，ABCA1蛋白表達(dá)量實(shí)驗(yàn)2組＞實(shí)驗(yàn)1組＞對(duì)照組，但差異不顯著;在頸動(dòng)脈，實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組ABCA1蛋白的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);在腹主動(dòng)脈，實(shí)驗(yàn)2組ABCA1蛋白表達(dá)量顯著高于實(shí)驗(yàn)1組(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)1組顯著

6、高于對(duì)照組(P＜0.05)。免疫組化定位ABCA1蛋白在動(dòng)脈內(nèi)膜增厚區(qū)大量表達(dá)，且表達(dá)量隨病變程度的加劇而升高。
　　(5)qRT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)2組肝臟中ABCA1表達(dá)量顯著高于對(duì)照組1和對(duì)照組(P＜0.05)。miR-33a在實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組肝臟中的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。miR-758在實(shí)驗(yàn)1組肝臟中表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，在實(shí)驗(yàn)2組中顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　(6)轉(zhuǎn)p

7、EGFP-N1-ABCA1的PK-15細(xì)胞可檢測(cè)到綠色熒光，且ABCA1 mRNA水平顯著上升。在胞質(zhì)注射的豬卵母細(xì)胞分裂期和囊胚期均能檢測(cè)到綠色熒光。
　　結(jié)論:高脂高糖和高脂高糖高膽固醇均可誘導(dǎo)廣西巴馬小型豬動(dòng)脈病變，后者引發(fā)的病變更為嚴(yán)重，說(shuō)明高水平膽固醇可加速動(dòng)脈病變進(jìn)程;病變區(qū)ABCA1表達(dá)量更高，說(shuō)明ABCA1主要在病變區(qū)發(fā)揮功能;高脂高糖可引發(fā)miRNA-33a下調(diào)，高膽固醇則可進(jìn)一步引發(fā)miRNA-758的下調(diào)，以