氧化修飾對高密度脂蛋白功能的影響及與ABCA1的關(guān)系.pdf

1、背景： 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是當(dāng)今危害人類健康的重大疾病之一，其所致心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率在我國和世界上均非常高。近年來隨著人們對AS實(shí)驗(yàn)和臨床研究的不斷深入，血脂在其中作用的研究已經(jīng)取得很大進(jìn)展，對高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)的研究也越來越深入，這對于揭開心血管疾病的發(fā)病機(jī)制起到了積極的推動作用。AS的兩個主要特征是血漿HDL水平的降低和動脈壁細(xì)

2、胞飽含膽固醇。細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝障礙是AS的重要發(fā)病機(jī)制，膽固醇從動脈壁細(xì)胞中的清除是預(yù)防AS的關(guān)鍵步驟。流行病學(xué)研究證實(shí)，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)具有抗AS作用，可抑制AS的發(fā)生發(fā)展，血清HDL-C水平與冠心病呈顯著負(fù)相關(guān)，這主要?dú)w因于HDL在膽固醇代謝尤其是膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)中所發(fā)揮的重要作用。HDL可將膽固醇從周圍組織(包括動脈粥樣斑塊)轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟進(jìn)行再循

3、環(huán)或以膽酸的形式排泄，這一過程就稱膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesteroltransport，RCT)。通過RCT，可以減少脂質(zhì)在血管壁的沉積。而一種稱之為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)的細(xì)胞膜蛋白介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)過剩的膽固醇向細(xì)胞外運(yùn)并形成HDL的代謝途徑。1999年，ABCAl的基因被發(fā)現(xiàn)，掀起了對ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特性研究的熱潮；許多資料發(fā)現(xiàn)A

4、BCA1在AS的發(fā)生中發(fā)揮作用：Wilcox等研究證實(shí)ABCA1不僅介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流，而且還與動脈粥樣硬化形成有明顯的關(guān)聯(lián)，動脈硬化區(qū)域ABCA1基因表達(dá)明顯上調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能改變是啟動AS發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。ABCA1的基因突變可導(dǎo)致丹吉爾病(Tangier disease，TD)、家族性HDL缺乏癥(familialhypo-alpha-lipoproteinemia，F(xiàn)HA)，表現(xiàn)為低高密度脂蛋白膽固醇血癥和早發(fā)冠心病。目前

5、認(rèn)為，正常外周細(xì)胞(單核/巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等)膜上的ABCAl首先介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的磷脂流出，并與細(xì)胞外的載脂蛋白AI(apolipoprotein AI，apoA I)結(jié)合形成盤狀的磷脂-apoA I復(fù)合物；然后細(xì)胞內(nèi)的膽固醇通過擴(kuò)散跨膜流出，被盤狀的磷脂-apoA I復(fù)合物捕獲，形成前β-HDL；在卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(lecithin cholesterol acvltransferase，LCAT)的作用下，轉(zhuǎn)

6、變成富含膽固醇酯的球狀的成熟HDL，由此啟動RCT。在人體內(nèi)，HDL具有高度的抗AS作用，其水平的降低已作為冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；同時(shí)，近年來大量研究顯示，人體內(nèi)還存在氧化型高密度脂蛋白(oxidized-high density lipoprotein，ox-HDL)。首先Nakajima等應(yīng)用Cu<'2+>氧化HDL的特異性抗體，通過組織化學(xué)分析方法，在人腹主動脈粥樣斑塊內(nèi)膜中就檢測到了ox-HDL的存在。隨后，Nakano等又證明

7、了以單克隆抗體為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)能靈敏地檢測出血漿中的ox-HDL，并具有可靠的特異性。另有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性高甘油三酯患者血漿中也存在ox-HDL。在體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)HDL暴露于能夠氧化LDL的物質(zhì)時(shí)，同樣也可以被銅離子、次氯酸等氧化劑，以及內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞所氧化。近年來有關(guān)ox-HDL的研究越來越深入，并取得了新的認(rèn)識。HDL在體內(nèi)的氧化機(jī)制如何，HDL被氧化修飾后結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了什么變化，其在AS形成過程中起著什么樣

8、的作用，以及如何防止HDL的氧化修飾、預(yù)防AS的發(fā)生，成為目前研究的重點(diǎn)，但這方面的研究相對較少。ABCAl在RCT中的重要作用為脂代謝和AS的研究提供了新的思路，進(jìn)一步研究ox-HDL對人類深入認(rèn)識脂代謝、AS有十分重要的意義，將使脂代謝異常、AS的治療邁上新的臺階。 目的： 本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)ECV-304細(xì)胞為研究對象，進(jìn)行HDL、ox-HDL、anti-ABCA1干預(yù)，通過觀察ECV-304細(xì)胞ABCAI的表達(dá)、膽

9、固醇的流出及其與HDL、ox-HDL相互結(jié)合情況來了解氧化修飾對HDL功能的影響及與ABCAI的關(guān)系，初步探討： 1．內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304 ABCA1表達(dá)的情況； 2．氧化修飾對HDL在ABCA1介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞膽固醇流出中作用的影響； 3．氧化修飾對HDL與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合的影響及與ABCA1的關(guān)系。 方法： 1．HDL的提取、氧化、DiI標(biāo)記及其鑒定：采用一次性密度梯度超速離心法，分離獲得HDL

10、(10℃，50 000 r/min，5 h)，并用Cu<'2+>進(jìn)行氧化修飾(37℃，50μmol/L，24h)及DiI進(jìn)行熒光標(biāo)記(37℃，15mg/ml，15h)；瓊脂糖凝膠電泳、Bradford蛋白質(zhì)定量及MDA測定對其進(jìn)行鑒定。 2．ECV-304細(xì)胞的培養(yǎng)及光境下觀察其形態(tài)。 3．ECV-304細(xì)胞ABCA1表達(dá)的情況：在培養(yǎng)ECV-304細(xì)胞中，加入1:100anti-ABCAl及1:200 FITC標(biāo)記的兔

11、抗羊二抗，熒光顯微鏡下觀察其表面ABCA1膜蛋白的表達(dá)4．HDL及ox-HDL對ECV-304細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的影響：將經(jīng)膽固醇和氧化型低密度脂蛋白處理的ECV-304細(xì)胞分五組，為A空白對照組，B HDL組，Cox-HDL組，D anti-ABCAI+HDL組，E anti-ABCAI+ox-HDL組，分別加入或不加入HDL、ox-HDL或anti-ABCAI，孵育24 h后，油紅O染色液、蘇木素染色，顯微鏡下觀察，細(xì)胞脂滴的面積等于

12、或大于細(xì)胞核的面積為油紅O染色細(xì)胞，每一塊玻片計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，采用單方向的方差分析對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 5．HDL及ox-HDL對ECV-304細(xì)胞的結(jié)合：將爬片的ECV-304細(xì)胞，分五組，為A空白對照組，B DiI-HDL組，C DiI-ox-HDL組，D anti-ABCAI+DiI-HDL組，E anti-ABCAl+DiI-ox-HDL組，分別加入或不加入熒光標(biāo)記的HDL或OX-HDL或anti-ABCA1，熒光顯微

13、鏡下觀察培養(yǎng)基中HDL及ox-HDL與ECV-304胞的相互結(jié)合情況。結(jié)果： 1．HDL的提取、氧化、DiI標(biāo)記及其鑒定：5小時(shí)內(nèi)成功分離出脂蛋白，并氧化、標(biāo)記了HDL；瓊脂糖凝膠電泳、Bradford蛋白質(zhì)定量(HDL氧化修飾前后的蛋白質(zhì)含量為2.62mg protein/ml和1.77mg protein/ml)及MDA測定(HDL氧化修飾前后的MDA含量分別為0.75±0.22 nmol/ml和14.60±1.75 nmo

14、l/ml，P=0.000)證實(shí)其為純度和濃度較高HDL及ox-HDL；DiI-HDL結(jié)合到體外培養(yǎng)的ECV-304細(xì)胞，表明DiI-HDL保持了正常脂蛋白的配體功能。 2．ECV-304細(xì)胞生長良好，形態(tài)正常。 3．ECV-304細(xì)胞表面觀察到紅色熒光物質(zhì)，即ECV-304細(xì)胞膜表達(dá)ABCA1。 4．HDL及ox-HDL對ECV-304細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的影響：A、B、C、D、E組每100個細(xì)胞油紅0染色細(xì)胞計(jì)數(shù)依

15、次為45±6、27±6、51±8、53±6、61±4，其中B組與A組比較，油紅0染色細(xì)胞數(shù)明顯減少(P=0.000)，C組與A組比較，油紅0染色細(xì)胞數(shù)無明顯減少或增加(P=0.129)，D、E組分別與A組比較，油紅0染色細(xì)胞數(shù)明顯增加(P=0.031，P=0.000)，C組與B組比較，油紅0染色細(xì)胞數(shù)明顯增加(P=0.000)，D組與B組比較，油紅0染色細(xì)胞數(shù)明顯增加(P=0.000)，E組與C組比較，油紅0染色細(xì)胞數(shù)明顯增加(P=0.

16、010)；表明在Anti-ABCA1條件下，ECV-304細(xì)胞膽固醇外流顯著減少；在無Anti-ABCA1條件下，HDL促進(jìn)ECV-304細(xì)胞膽固醇外流，ox-HDL無促進(jìn)ECV-304細(xì)胞膽固醇外流。 5．HDL及ox-HDL對ECV-304細(xì)胞的結(jié)合：在有或無Anti-ABCA1條件下，DiI-HDL、DiI-ox-HDL均可結(jié)合到ECV-304細(xì)胞表面，但與DiI-HDL對比，DiI-ox-HDL與ECV-304細(xì)胞結(jié)合明

17、顯減弱。 結(jié)論： 1．本研究縮短了HDL提取的超速離心時(shí)間并降低了標(biāo)記成本，效果理想，可成功應(yīng)用于脂蛋白受體的研究； 2．血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304能夠表達(dá)ABCA1: 3．ABCA1介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)，其抗體阻斷后逆轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇能力下降；HDL發(fā)生氧化修飾后發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，影響了血管內(nèi)皮細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的功能； 4．HDL發(fā)生氧化修飾后發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，影響了其與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合；HDL