氧化高密度脂蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的兔樹突狀細(xì)胞的成熟與趨化因子MCP-1分泌的影響.pdf

1、冠心病（coronary heart disease，CHD）是最常見的心腦血管疾病之一，其發(fā)病率逐漸增高，1998年至2008年間，我國(guó)男性冠心病發(fā)病率較以往同期約增加26%，女性約增加19%，其死亡率也呈迅速上升趨勢(shì)，是我國(guó)居民死因構(gòu)成中上升最快的疾病，已成為威脅我國(guó)公眾健康的重要疾病，如何有效防治是醫(yī)療行業(yè)和社會(huì)關(guān)注的重點(diǎn)。但是CHD的發(fā)病機(jī)制至今仍不完全明了，成為阻礙其治療進(jìn)展的主要難題。動(dòng)脈粥樣硬化（atheroscleros

2、is，AS）是CHD的主要病理基礎(chǔ)。以往關(guān)于AS形成的機(jī)制主要圍繞三種學(xué)說：脂質(zhì)沉淀學(xué)說、損傷修復(fù)學(xué)說和血栓形成學(xué)說。高血壓、吸煙、血脂異常、糖尿病、超重和肥胖、年齡、性別、高半胱氨酸血癥以及高尿酸血癥等導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和脂質(zhì)沉積的內(nèi)在因素，被認(rèn)為是CHD發(fā)病的高危因素。遠(yuǎn)離這些危險(xiǎn)因素，或者控制這些因素的惡化，均可在一定程度上取得預(yù)防AS發(fā)生發(fā)展的效果。近年來，隨著急性冠脈綜合癥（acute coronary syndrome，ACS

3、）這個(gè)CHD的急性進(jìn)展階段的界定，使得人們重新認(rèn)識(shí)了CHD發(fā)展階段的病理和病理生理特點(diǎn)。ACS的病理基礎(chǔ)是易損斑塊，研究發(fā)現(xiàn)易損斑塊伴隨著大量炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞的介入，是斑塊不穩(wěn)定和容易破裂的主要原因；ACS患者存在全身炎癥因子和炎癥反應(yīng)活化的情況。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AS的所有階段都有免疫細(xì)胞的介入，于是提出CHD是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病這一新觀點(diǎn)，認(rèn)為內(nèi)在或外在危險(xiǎn)因素導(dǎo)致的炎癥和免疫反應(yīng)是AS發(fā)病的基礎(chǔ)。 本課題分為兩個(gè)部

4、分，第一部分研究在hGM-CSF+hIL-4作用下體外培養(yǎng)。誘導(dǎo)兔外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）以及骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow monouclear cells，BMMC）轉(zhuǎn)化為DCs的方法，并采取LPS誘導(dǎo)DCs的成熟，旨在為AS的組織工程和臨床細(xì)胞診斷、治療的研究奠定基礎(chǔ)。第二部分利用熒光染料DiI標(biāo)記ox-HDL，在體外觀察DCs對(duì)其的捕獲過程及ox-H

5、DL誘導(dǎo)DCs成熟情況，探討ox-HDL對(duì)DCs成熟的影響，并利用ELISA方法，在體外觀察ox-HDL對(duì)DCs趨化因子MIP-1α和MCP-1分泌，為進(jìn)一步研究ox-HDL抗原呈遞機(jī)制及動(dòng)脈粥樣硬化形成機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。其結(jié)果分述如下： 1兔PBMC源性及BMMC源性DCs體外培養(yǎng)的研究 通過密度梯度離心的方法收集到的單只兔外周血20mL轉(zhuǎn)化為DCs的數(shù)量約為10-20×106，單只兔骨髓液10mL轉(zhuǎn)化為DCs的數(shù)量約

6、為5-10×106。 1.1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)結(jié)果 培養(yǎng)第2天對(duì)照組細(xì)胞粘附于聚苯乙烯培養(yǎng)瓶底部，DC組的細(xì)胞部分在培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞較小，形態(tài)無明顯差別。培養(yǎng)第6天對(duì)照組的細(xì)胞呈圓形或橢圓形，粘附于培養(yǎng)瓶瓶底，掃描電鏡下細(xì)胞呈圓形及橢圓形，表面有小桿狀突起；DC組的細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，可見部分細(xì)胞聚集成簇，細(xì)胞表面可見數(shù)量不等、形態(tài)不一的樹突樣突起，掃描電鏡下細(xì)胞呈不規(guī)則形，表面粗糙，胞體有形態(tài)不一的突起。 1.2細(xì)胞

7、的流式細(xì)胞學(xué)表型分析結(jié)果 培養(yǎng)6天后外周血源性DC組與骨髓源性DC組的細(xì)胞MHCⅡ、CD86高表達(dá)，CD14低表達(dá)。相同來源的不同細(xì)胞各組間行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)：外周血源性DC組與外周血源性對(duì)照組的MHCⅡ、CD86、CD14比較差異有顯著性意義（P<0.001），骨髓源性DC組與骨髓源性對(duì)照組MHCⅡ、CD86、CD14比較差異有顯著性意義（P<0.001）。不同來源的同類細(xì)胞行各組間行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)：外周血源性DC組與骨髓源性D

8、C組的MHCⅡ、CD86、CD14比較差異無顯著性意義（P>0.05），外周血源性對(duì)照組與骨髓源性對(duì)照組的MHCⅡ、CD86、CD14比較差異無顯著性意義（P>0.05）。析因設(shè)計(jì)資料的方差分析提示不同標(biāo)本來源的細(xì)胞間比較差異無顯著性意義（P>0.05），不同刺激方法培養(yǎng)的細(xì)胞間比較差異有顯著性意義（P<0.001）。 1.3吞噬功能檢測(cè) 成熟DCs的吞噬功能下降，主要表現(xiàn)為抗原呈遞功能，為此用流式的方法比較巨噬細(xì)胞和成

9、熟DCs在37℃條件下對(duì)FITC-dextran的攝取能力的差異。析因設(shè)計(jì)資料的方差分析提示不同標(biāo)本來源的細(xì)胞間比較差異無顯著性意義（P>0.05），不同刺激方法培養(yǎng)的細(xì)胞間比較差異有顯著性意義（P<0.001）。兩組間獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，外周血源性DCs組和骨髓源性DCs組細(xì)胞吞噬能力表達(dá)較低，兩種來源的對(duì)照組細(xì)胞吞噬能力表達(dá)較強(qiáng)。外周血源性DC組與骨髓源性DC組之間、外周血源性對(duì)照組與骨髓源性對(duì)照組之間比較差異無顯著性意義（P>

10、0.05），外周血源性DC組與外周血源性對(duì)照組之間、骨髓源性DC組與骨髓源性對(duì)照組之間比較差異有顯著性意義（P<0.001）。 2 ox-HDL對(duì)兔PBMC源性DCs的成熟及趨化因子分泌的影響 2.1 DCs的培養(yǎng)和觀察 倒置相差顯微鏡下：培養(yǎng)第2天各組細(xì)胞部分在培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞較小，圓形。培養(yǎng)第5天細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，可見部分細(xì)胞聚集成簇，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面可見數(shù)量不等、形態(tài)不一的樹突樣突起，細(xì)胞質(zhì)變得豐富。

11、加入50μg/mLHDL、ox-HDL后，細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，細(xì)胞大部分懸浮或半貼壁，少數(shù)貼壁。 2.2 DCs對(duì)DiI標(biāo)記的ox-HDL的加工處理和抗原呈遞 DCs與DiI標(biāo)記的ox-HDL混合孵育2小時(shí)，熒光顯微鏡觀察顯示原本無色的DCs，在攝取了經(jīng)DiI標(biāo)記的ox-HDL后，胞漿也變的紅染，培養(yǎng)2天后，這種情況則顯示更為明顯。DiI良好顯示DCs攝取ox-HDL抗原和成熟過程。DCs開始為較小的幼稚多形細(xì)胞，其攝

12、取抗原過程清晰可見，在攝取抗原后逐漸發(fā)育變大，胞漿逐漸豐富，變?yōu)椴灰?guī)則多型狀態(tài)，并有較多偽足伸出。 2.3 ox-HDL對(duì)DCs表型的影響 收集干預(yù)48h的懸浮細(xì)胞，經(jīng)FACS分析顯示，與陰性對(duì)照PBS組相比，經(jīng)HDL及ox-HDL處理的DCs其表面分子CD86和MHCⅡ的表達(dá)均上調(diào)，CD14的表達(dá)均下調(diào)。行One-Way ANOVA檢驗(yàn)，MHCⅡ、CD86、CD14（CD14方差不齊，采用Welch法校正）在各組間差異

13、有顯著性意義（P<0.001）。Dunnett'sT3多重比較提示HDL組與PBS組的MHCⅡ、CD86、CD14比較差異無顯著性意義（P>0.05），ox-HDL組與PBS組之間（P<0.001）、ox-HDL組與HDL組之間（P<0.01）的MHCⅡ、CD86、CD14比較差異均有顯著性意義。 2.4與ox-HDL共同培養(yǎng)的DCs上清液趨化因子MIP-1α和MCP-1檢測(cè)結(jié)果： 上清液趨化因子MIP-1α的ELISA

14、檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行析因設(shè)計(jì)資料的方差分析提示：時(shí)間因素對(duì)上清液的MIP-1α表達(dá)量的影響有顯著性意義（F=34.520，P<0.001），分組因素（培養(yǎng)環(huán)境中的干預(yù)因素）對(duì)上清液的MIP-1α表達(dá)量的影響無顯著性意義（F=0.722，P>0.05）。繼續(xù)行One-Way ANOVA檢驗(yàn)顯示不同時(shí)間段的MIP-1α表達(dá)量不同，多重比較顯示除HDL組在24小時(shí)與48小時(shí)之間差異無顯著性意義外（P=0.102），其余各時(shí)間段之間的兩兩比較，其MIP

15、-1α表達(dá)量差異均有顯著性意義（P<0.05），但是不同分組，即按不同干預(yù)條件對(duì)各時(shí)間段的上清液MIP-1α表達(dá)量影響均無顯著性意義（P>0.05）。 上清液趨化因子MCP-1的ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行析因設(shè)計(jì)資料的方差分析提示：時(shí)間因素對(duì)上清液的MCP-1表達(dá)量的影響有顯著性意義（F=31.481，P<0.001），分組因素對(duì)上清液的MIP-1α表達(dá)量的影響有顯著性意義（F=47.931，P<0.001）。繼續(xù)行One-Way

16、ANOVA及Dunnett's T3多重比較提示：不同時(shí)間段的MCP-1表達(dá)量不同，除PBS組在12小時(shí)與24小時(shí)之間差異無顯著性意義外（P=0.383），其余各時(shí)間段之間的兩兩比較，MCP-1表達(dá)量差異均有顯著性意義（P<0.001）。不同分組，即不同干預(yù)條件對(duì)各時(shí)間段的上清液MCP-1表達(dá)量影響差異有顯著性意義（P<0.001），多重比較顯示ox-HDL的影響與其他因素單獨(dú)比較，在各時(shí)間段的差異均有顯著性意義（P<0.05）。

17、 通過上述兩個(gè)章節(jié)實(shí)驗(yàn)，我們總結(jié)以下結(jié)論和創(chuàng)新： （1）兔PBMC及BMMC均能在hGM-CSF+hIL-4的作用下經(jīng)過5天的培養(yǎng)被誘導(dǎo)分化為DCs，但PBMC源性的DCs表型表達(dá)的陽(yáng)性率高于BMMC源性的DCs。經(jīng)過LPS的作用，兩種來源的DCs均能轉(zhuǎn)化為成熟樹突狀細(xì)胞； （2）體外培養(yǎng)的兔PBMC源性DCs經(jīng)過ox-HDL的干預(yù)，其CD86、MHCⅡ表達(dá)上調(diào)，CD14表達(dá)下調(diào)，符合成熟DCs的特征。 （3）