側(cè)腦室注射CART對(duì)T2DM大鼠胰島素調(diào)節(jié)作用及機(jī)制初步研究.pdf

1、1.背景與目的:
　　2型糖尿病是一種代謝性疾病,病理過程是由胰島素抵抗為主伴胰島素相對(duì)不足逐漸發(fā)展成為胰島素分泌缺陷為主伴胰島素抵抗,以至于人體不能有效利用胰島素,使患者體內(nèi)的胰島素處于一種相對(duì)缺乏狀態(tài);典型癥狀是“三多一少”,即多尿、多食、多飲及消瘦;主要特征是慢性血葡萄糖水平增高;主要原因是胰島素作用缺陷和/或胰島素分泌紊亂;長期的高血糖水平對(duì)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,繼發(fā)引起脂代謝紊亂,影響心臟、腎臟、肝臟及神經(jīng)等功能,導(dǎo)致

2、心腦血管并發(fā)癥、糖尿病腎病、糖尿病肝病、神經(jīng)病變以及周圍血管病變等多種并發(fā)癥。因此促進(jìn)胰島素分泌,降低血糖水平成為治療2型糖尿病的重要策略。
　　可卡因-苯丙胺轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)肽(cocaine and amphetamine regulated transcript,CART)是一種重要的內(nèi)源性神經(jīng)肽,廣泛分布在大腦和胃腸系統(tǒng)中,參與調(diào)節(jié)食物攝入量、體重、感知覺、中樞神經(jīng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)以及內(nèi)分泌等多種生理功能。研究表明人類CART基因定

3、位于染色體5q13–14,此區(qū)域已證明是一個(gè)肥胖易感位點(diǎn),這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明CART參與了進(jìn)食調(diào)節(jié)及在人類肥胖癥中參與了能量平衡的作用。人類CART基因突變使得其代謝率降低,發(fā)生2型糖尿病的幾率更高。在CART基因敲除小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)其β細(xì)胞形態(tài)有所改變,葡萄糖刺激胰島素分泌(GSIS)功能受到抑制,體重明顯增加,胰島功能減退,提示CART可能具有維持正常胰島功能的作用。CART除了在胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞表達(dá)外,同時(shí)在胰腺神經(jīng)纖維和胰腺神經(jīng)節(jié)胞體

4、中也有廣泛表達(dá)。大鼠胰腺組織中的副交感神經(jīng)能刺激胰島素分泌,因此CART在胰腺副交感神經(jīng)中的表達(dá)提示CART不僅能調(diào)節(jié)胰島內(nèi)分泌細(xì)胞功能,還參與調(diào)節(jié)副交感神經(jīng)調(diào)控的胰島功能。CART作為一種新型的內(nèi)源性神經(jīng)肽,具有活性高、毒副作用低和耐受性好等優(yōu)點(diǎn),因其具有控制胰島功能,調(diào)節(jié)胰島素分泌的特點(diǎn)成為治療2型糖尿病的熱點(diǎn)研究藥物。側(cè)腦室(LV)周圍連接著各種重要核團(tuán),是腦脊液循環(huán)的重要樞紐,在臨床應(yīng)用和動(dòng)物試驗(yàn)中將側(cè)腦室給藥作為常用給藥途徑。

5、因此我們?cè)诒菊n題中選擇側(cè)腦室給藥作為給藥途徑,注射CART后研究其對(duì)胰腺組織中胰島素的調(diào)節(jié)作用,并對(duì)機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　2.研究?jī)?nèi)容:
　　2.1.第一部分:側(cè)腦室注射CART對(duì)2型糖尿病大鼠血中TC、TG、HDLC、LDLC和HbA1C含量影響
　　2.2.第二部分:側(cè)腦室注射CART對(duì)2型糖尿病大鼠FBG、空腹胰島素、血糖藥時(shí)曲線下面積(AUC)、血清胰島素藥時(shí)曲線下面積以及組織胰島素影響
　　2.3.

6、第三部分:側(cè)腦室注射CART對(duì)2型糖尿病大鼠胰腺組織INS mRNA影響
　　2.4.第四部分:大鼠胰腺組織中CART和INS定位及側(cè)腦室注射CART干預(yù)前后對(duì)胰腺組織中CART和INS表達(dá)影響
　　2.5.第五部分:CART對(duì)2型糖尿病大鼠胰島INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響
　　3.方法:
　　3.1.動(dòng)物分組和建立2型糖尿病大鼠模型將健康SD雄性大鼠禁食12小時(shí)后,剪尾取血并測(cè)定FBG小于10mmol/L者,

7、按照隨機(jī)數(shù)字法分成6組:⑴正常組;⑵正常/LV注射ACSF組;⑶正常/LV注射CART組;⑷2型糖尿病組;⑸2型糖尿病/LV注射ACSF組;⑹2型糖尿病/LV注射CART組。將糖尿病組、糖尿病/LV注射ACSF組和糖尿病/LV注射 CART組大鼠使用高糖高脂飼料喂食4周,禁食12小時(shí)后,以40mg/kg鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)進(jìn)行腹腔注射,用于建立2型糖尿病大鼠模型。72小時(shí)后采用剪尾取血測(cè)定其FBG大于16

8、.7 mmol/L者,即為2型糖尿病造模成功。
　　3.2.側(cè)腦室注射ACSF/CART及血液中TC、TG、HDLC、LDLC和HbA1C含量檢測(cè)在確定造模成功24小時(shí)后,將空腹的正常/LV注射ACSF組、正常/LV注射CART組、糖尿病/LV注射ACSF組和糖尿病/LV注射CART組分別麻醉后,使用腦定位儀并結(jié)合大鼠腦圖譜對(duì)側(cè)腦室進(jìn)行定位、開孔,分別注入0.2nmol ACSF/CART。24小時(shí)后采用腹主動(dòng)脈取血,測(cè)定其TC、

9、TG、HDLC、LDLC和HbA1C含量。
　　3.3.觀察側(cè)腦室注射CART干預(yù)前后對(duì)各組大鼠口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT),血糖值和胰島素藥時(shí)曲線下面積的影響采用OGTT法檢測(cè)CART干預(yù)前后FBG、空腹胰島素、血糖值A(chǔ)UC和血清胰島素AUC含量,并比較各組之間血糖值和胰島素藥時(shí)曲線下面積變化。
　　3.4.觀察側(cè)腦室注射CART干預(yù)前后對(duì)大鼠胰腺組織中胰島素的影響采用ELISA法測(cè)定使用CART干預(yù)前后大鼠胰腺組織中胰

10、島素含量。
　　3.5.觀察側(cè)腦室注射CART干預(yù)前后對(duì)大鼠胰腺組織中INS mRNA影響采用熒光定量PCR觀察各組大鼠在CART干預(yù)前后胰腺組織中INS mRNA表達(dá)變化
　　3.6.觀察大鼠胰腺組織中CART和INS定位及側(cè)腦室注射CART干預(yù)前后對(duì)胰腺組織中CART和INS表達(dá)影響采用免疫熒光分析胰腺組織中CART和INS定位,并比較CART干預(yù)前后CART和INS表達(dá)變化。
　　3.7.觀察大鼠INS-1細(xì)胞使

11、用CART和GLP-1干預(yù)后胰島素含量變化培養(yǎng)胰島INS-1細(xì)胞,用ELISA法測(cè)定CART和GLP-1干預(yù)后細(xì)胞分泌胰島素含量。
　　4.結(jié)果:
　　4.1.檢測(cè)側(cè)腦室注射CART干預(yù)前后各組大鼠血中TC、TG、HDLC、LDLC和HbA1C含量2型糖尿病大鼠血中TC、TG、LDLC和HbA1C與正常對(duì)照大鼠相比均有顯著上升(P<0.05);2型糖尿病大鼠采用CART干預(yù)后,血中TC與糖尿病大鼠相比有顯著改善(P<0.05

12、)。
　　4.2.側(cè)腦室注射CART干預(yù)前后對(duì)各組大鼠口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)FBG、空腹血清胰島素、血糖AUC和血清胰島素AUC影響通過采用OGTT試驗(yàn)將各組大鼠使用CART干預(yù)前后FBG、空腹血清胰島素、血糖AUC和血清胰島素AUC進(jìn)行比較表明:CART干預(yù)后FBG明顯降低(P<0.05),空腹胰島素含量顯著增加(P<0.05),但不能達(dá)到正常水平,2型糖尿病大鼠中FBG和空腹胰島素與正常對(duì)照大鼠相比有顯著性差異(P<0

13、.05);2型糖尿病大鼠在CART干預(yù)前后血糖值A(chǔ)UC和胰島素AUC改變不明顯,提示CART干預(yù)后24小時(shí)內(nèi)只是改變了FBG,促進(jìn)了胰島素分泌,并沒有改變其糖尿病性質(zhì)。
　　4.3.側(cè)腦室注射CART干預(yù)前后對(duì)大鼠胰腺組織中胰島素的影響通過采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定各組大鼠注射CART干預(yù)前后胰島素含量表明:2型糖尿病大鼠注射CART干預(yù)后胰腺組織中胰島素含量與糖尿病模型相比明顯上升(P<0.05),尤其是正常對(duì)照大鼠采用CART干預(yù)

14、后胰島素含量有顯著性提高(P<0.05),提示CART能夠提高胰腺組織中胰島素含量。
　　4.4.側(cè)腦室注射CART干預(yù)前后對(duì)大鼠胰腺組織中INS mRNA的影響通過采用熒光定量PCR法測(cè)定各組大鼠使用CART干預(yù)前后胰腺組織中INS mRNA表達(dá)量表明:2型糖尿病大鼠注射CART干預(yù)后胰腺組織中INS mRNA表達(dá)量與糖尿病大鼠相比明顯上升(P<0.05)。尤其是正常對(duì)照大鼠在CART干預(yù)后胰腺組織中INS mRNA表達(dá)量有顯著

15、性提高(P<0.05),提示CART能夠促進(jìn)胰腺組織中胰島素分泌。
　　4.5.大鼠胰腺組織中CART和INS定位及側(cè)腦室注射CART干預(yù)前后對(duì)胰腺組織中CART和INS表達(dá)影響采用免疫熒光分析對(duì)胰腺組織中CART和INS定位及CART干預(yù)前后CART和INS表達(dá)變化表明:CART和INS均在胰島β細(xì)胞中表達(dá),使用CART干預(yù)后胰腺組織中CART和INS表達(dá)均有所增強(qiáng),提示側(cè)腦室注射CART可能促進(jìn)胰腺組織中CART增強(qiáng),并進(jìn)一步

16、促進(jìn)了胰島素分泌。
　　4.6.CART對(duì)2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞胰島素分泌的影響采用ELISA法測(cè)定由CART和GLP-1干預(yù)后的胰腺INS-1細(xì)胞所分泌胰島素含量表明:CART和GLP-1均能明顯刺激INS-1細(xì)胞分泌胰島素(P<0.05),其中GLP-1效果更加顯著(P<0.05)。
　　5.結(jié)論:
　　5.1.本研究采用高糖高脂飲食/腹腔注射大劑量STZ誘導(dǎo)空腹血糖上升和脂類代謝紊亂,成功建立大鼠2型糖尿病模型。

17、在2型糖尿病大鼠側(cè)腦室注射CART24小時(shí)后能夠明顯降低其FBG和TC,提高空腹胰島素含量,但血糖ACU及血清胰島素AUC未有明顯改變,表明CART能夠促進(jìn)胰島素分泌,降低空腹血糖,改善TC代謝,但并不能改變其糖尿病本質(zhì)。
　　5.2.大鼠側(cè)腦室注射CART干預(yù)后組織中胰島素含量及INS mRNA表達(dá)量明顯上調(diào),表明CART能夠促進(jìn)β細(xì)胞胰島素分泌,并且在β細(xì)胞未受損情況下效果更加顯著。
　　5.3.免疫熒光分析表明CART