胰島素對燒傷早期內皮細胞功能紊亂的正性調節(jié)作用及分子機制.pdf

1、研究背景：
　　多器官功能障礙綜合癥（MODS）是引起嚴重燒傷患者死亡的主要原因之一。雖然引起MODS的病理生理過程紛繁復雜，但隨著研究的深入人們逐漸達成共識，血管內皮細胞的功能紊亂是這一病理生理過程的中心環(huán)節(jié)。而在嚴重燒傷早期，血管內皮細胞的功能紊亂主要表現(xiàn)為燒傷后內皮細胞“毛細血管滲漏”及隨之而來的間質水腫。
　　危重病患者時常伴有胰島素抵抗和高血糖，而這種“創(chuàng)傷后胰島素抵抗”的嚴重程度往往反映了這些危重病患者（如嚴重創(chuàng)

2、傷、嚴重燒傷及膿毒癥）的死亡風險。在一個外科重癥監(jiān)護病房的前瞻性研究中，人們發(fā)現(xiàn)強化胰島素治療來嚴格控制血糖水平可明顯減少嚴重感染、器官衰竭以及死亡率。在關于其機制的探討中，一些研究人員認為代謝調節(jié)機制是強化胰島素治療的唯一作用途徑。然而，近年來人們逐漸發(fā)現(xiàn)胰島素還具有抗炎、抗凋亡、促細胞增殖以及調節(jié)機體免疫功能的特性。也就是說胰島素除了具有代謝調節(jié)特性外還具有非代謝作用機制。近期又有研究報道強化胰島素治療具有內皮細胞保護作用并認為其可

3、能是阻止危重病患者多臟器衰竭和死亡的重要機制。但到目前為止，危重病患者強化胰島素治療的確切機制仍不清楚。
　　在本課題中，我們主要是探討胰島素對嚴重燒傷后內皮細胞功能紊亂的調節(jié)作用。首先，在體嚴重燒傷動物模型上，利用強化胰島素處理觀察其對急性肺損傷的作用。我們的設想是強化胰島素處理是否可以通過對微血管內皮細胞的保護，防止微血管滲漏，從而達到減輕燒傷后肺組織水腫、出血及炎性細胞浸潤的目的。在此基礎上，我們進一步體外利用臍靜脈血管內皮

4、細胞，觀察胰島素干預后內皮細胞單分子通透性與細胞緊密連接以及凋亡的變化和內在聯(lián)系，并就可能存在的細胞內信號傳導機制進行相關研究。
　　方法：
　　1.雄性SD大鼠75只，隨機分成假燙組、燙傷組（30％TBSAⅢ○），燙傷+胰島素處理組。氧化酶法測定燙傷后24小時內大鼠血糖變化。燙傷12小時后，HE染色觀察肺臟病理變化，檢測肺臟髓過氧化物酶（MPO）、血清超氧化物歧化酶（SOD）以及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量變化。

5、同時，電鏡觀察肺微血管內皮細胞變化，比色法檢測各型一氧化氮合酶及血清一氧化氮（NO）水平。
　　2.體外培養(yǎng)原代人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC），隨機分為空白對照組、20％（V/V）人正常血清刺激組、20％（V/V）人燒傷血清刺激組、20％（V/V）人燒傷血清+胰島素處理組及抑制劑（LY-294002）組，利用生物素標記的BSA測定內皮細胞單分子通透性變化，羅丹明-鬼筆環(huán)肽標記細胞骨架并觀察，同時利用蛋白印跡法檢測帶狀閉合蛋白-

6、1（ZO-1）、咬合蛋白及磷酸化蛋白激酶B（AKT）的變化情況。
　　3.體外培養(yǎng)的原代人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），隨機被分為空白對照組、20％（V/V）人正常血清刺激組、20％（V/V）人燒傷血清刺激組、20％（V/V）人燒傷血清+胰島素處理組，刺激6小時后運用原位末端標記（TUNEL）法觀察內皮細胞凋亡，分別采用免疫組織化學染色法和（或）蛋白印跡法檢測抗凋亡蛋白bcl-2及eNOS的蛋白表達情況。
　　4.體外原代培

7、養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），隨機被分為空白對照組、20％（V/V）正常人血清刺激組、20％（V/V）燒傷人血清刺激組、20％（V/V）燒傷人血清+胰島素（10-7mol/L）處理組及抑制劑（LY-294002）組。ELISA法檢測采集血清中IL-1β和TNF-α的水平。刺激6小時后，蛋白印跡法檢測HUVEC胞漿抑制酶κB-α（IκB-α）和胞核NF-κB-p65的蛋白表達變化。
　　結果:
　　1.強化胰島素處理明顯減

8、輕燒傷后大鼠的肺組織水腫、出血及炎性細胞浸潤。BALF中蛋白含量和肺組織MPO含量明顯減少（P<0.05），而血清SOD增加明顯（P<0.01）。肺微血管透射電鏡下觀察強化胰島素處理組較單純燙傷組內皮細胞受損程度明顯改善。強化胰島素處理組血清NO、血清總一氧化氮合酶(NOS)和結構型一氧化氮合酶(cNOS)含量較單純燙傷組均明顯增加（P<0.01）。
　　2.體外實驗中，內皮細胞單分子通透性在燒傷血清刺激下明顯增加，胰島素干預（1

9、0-7mol/L）可阻斷其損傷效應。同時觀察發(fā)現(xiàn)，胰島素干預（10-7mol/L）后燒傷血清刺激引起的內皮細胞張力絲形成減少，ZO-1蛋白表達降低。應用AKT特異性阻斷劑后在阻斷了AKT磷酸化的同時胰島素的上述保護效應也隨之減弱或消失。
　　3.與空白對照組比較，燒傷血清可明顯促進內皮細胞凋亡，bcl-2和p-eNOS蛋白表達降低（P<0.01）。相對于單純燒傷血清刺激組，胰島素處理組（10-7mol/L）細胞凋亡顯著減少，bcl

10、-2和p-eNOS蛋白表達明顯恢復（P<0.01）。eNOS在各組中無明顯變化。
　　4.與空白對照組比較，燒傷血清誘導了HUVEC的損傷，胞漿p-IκB-α和胞核NF-κB-p65蛋白表達增多。相對于單純燒傷血清刺激組，胰島素處理組HUVEC損傷減輕，胞漿IκB-α的磷酸化和NF-κB-p65核移位明顯減輕。AKT特異性抑制劑（LY294002）能夠消除胰島素對燒傷血清誘導HUVEC的NF-κB-p65核移位抑制作用。
　

11、　結論:
　　1.在體動物實驗，強化胰島素處理有效改善嚴重燒傷所致的急性肺損傷，其中胰島素的血管內皮細胞保護作用可能發(fā)揮著關鍵的作用。
　　2.體外細胞實驗，胰島素通過PI3K/AKT途徑減輕燒傷血清刺激下的血管通透性增高。其中，內皮細胞細胞骨架重排及緊密連接相關蛋白的有效保護是其作用關鍵，這一機制的發(fā)現(xiàn)對燒傷后多臟器衰竭的防治意義重大。
　　3.體外細胞實驗，胰島素可增加燒傷血清誘導下抗凋亡蛋白bcl-2的表達并抑制