袖狀胃切除術(shù)影響脂肪組織caveolin-1表達(dá)在改善胰島素抵抗與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用研究.pdf

1、目的:
　　本研究擬進一步應(yīng)用3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成3T3-L1脂肪細(xì)胞，然后誘導(dǎo)成胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞，通過檢測并比較胰島素抵抗后的3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取率及caveolin-1、IR、GLUT4以及ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的改變，初步在細(xì)胞水平考察胰島素抵抗時caveolin-1與ERS的關(guān)系;進一步在胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過表達(dá)caveolin-1的慢病毒質(zhì)粒(LV-Cav1)及cave

2、olin-1沉默的慢病毒質(zhì)粒(LV-Cav1-RNAi)，并葡萄糖攝取率及caveolin-1、IR、GLUT4以及ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的改變，探討分析干預(yù)caveolin-1表達(dá)影響ERS改變對脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的作用。本研究將為探索脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的新機制，以及尋找改善胰島素抵抗的新手段提供重要的依據(jù)。
　　實驗方法:
　　1、db/db小鼠30只機分配至3組:db/db組（10只），袖狀胃切除術(shù)組db/db-SG組（1

3、0只），假手術(shù)組db/db-sham組（10只）;10只同窩野生型小鼠(db/m)作為陰性對照組db/m組（10只）參與實驗。
　　2、3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化、建立胰島素抵抗模型成功后入選實驗，流式細(xì)胞術(shù)觀察胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取，進一步探討caveolin-1改善脂肪細(xì)胞胰島素抵抗作用的機制。
　　實驗結(jié)果:
　　一、手術(shù)結(jié)果
　　SG組大鼠術(shù)后死亡1只，死因為吻合口出血（術(shù)后第1天），d

4、b/db-sham組術(shù)后7天死于切口感染1只，其他組無死亡。
　　二、術(shù)后小鼠體重變化
　　術(shù)前db/db-SG、db/db-sham及db/db組小鼠體重明顯高于db/m組，但db/db3個組別相比，組間體重?zé)o顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后1周起，db/db-SG、db/db-sham組小鼠體重均有不同程度降低，術(shù)后3周時體重有所增加，并維持在該水平。db/db-SG組降低明顯與其他兩組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

5、r>　　三、術(shù)后攝食量的變化
　　術(shù)前db/db各組間攝食量無顯著性差異。術(shù)后SG組攝食量明顯下降，21天時有略上升趨勢，但仍低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。
　　四、術(shù)前、術(shù)后空腹血糖(FBS)的變化
　　術(shù)前db/db-SG組、db/db-sham組、db/db組FBS水平明顯高于db/m組，差異具有顯著性（P均＜0.01）。術(shù)后30天時SG組FBS值已基本降至正常范圍，并與db/m組無顯著性差異

6、。
　　五、術(shù)后口服葡萄糖耐量的變化
　　術(shù)前db/db-SG組、db/db-sham組、db/db組OGTT曲線下面積(area under curve，AUC)值顯著大于db/m對照組（P均＜0.05）。術(shù)后30天時，SG組AUC值顯著降低，與db/m組無差異顯著性，db/db-SG組AUC值顯著低于db/db-sham和db/db組對照組(P＜0.01)。
　　六、術(shù)后血清胰島素的變化
　　術(shù)前db/db-

7、SG組、db/db-sham組、db/db組小鼠基礎(chǔ)餐前胰島素水平無差異，且均高于db/m對照組(P＜0.05)，餐后胰島素水平進一步升高，亦明顯高于對照組。術(shù)后SG組血清空腹胰島素及餐后胰島素水平下降，低于db/db-sham及db/db組(P＜0.05)，與db/m組相比無明顯差異（P＞0.05）。
　　七、手術(shù)對db/db小鼠胰島素抵抗的影響
　　術(shù)前術(shù)前db/db-SG組、db/db-sham組、db/db組小鼠HO

8、MA-IR值均顯著高于db/m組，表明術(shù)前db/db小鼠存在明顯的胰島素抵抗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05)。術(shù)后SG組HOMA-IR值明顯降低，并與db/m組HOMA-IR值無明顯差異(P＞0.05)，而該兩組HOMA-IR值明顯低于db/db組及db/db-sham組，有顯著性差異（P＜0.01）。
　　八、手術(shù)對血清TC、TG、LDL的影響
　　術(shù)前db/db-SG組、db/db-sham組及db/db組TC、TG

9、、LDL值顯著高于對照組（P均＜0.01）。術(shù)后30天時，SG組TC、TG、LDL值明顯下降，低于db/db-sham組及db/db組(P均＜0.01)。
　　九、手術(shù)對血清脂聯(lián)素的影響
　　術(shù)前db/db-SG組、db/db-sham組及db/db組脂聯(lián)素水平顯著低于db/m對照組。術(shù)后30天時，db/db-SG組脂聯(lián)素明顯升高，與db/db-sham組及db/db組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　十、免疫組

10、織化學(xué)法檢測脂肪組織caveolin-1及GLUT4表達(dá)
　　通過免疫組化檢測各組小鼠附睪脂肪組織caveolin-1及GLUT4的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn):與db/m小鼠比，db/db小鼠的caveolin-1及GLUT4的表達(dá)減弱;而與db/db小鼠比，db/db-SG組小鼠的caveolin-1及GLUT4的表達(dá)增強，而db/db-sham組無明顯改變。
　　十一、SG手術(shù)對小鼠脂肪組織caveolin-1、GLUT4、en

11、docanmRNA表達(dá)的影響
　　Real-time quantitative PCR檢測小鼠附睪脂肪組織caveolin-1及GLUT4 mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果顯示db/db-SG組小鼠脂肪組織caveolin-1及GLUT4mRNA表達(dá)較db/db組和db/db-sham組均明顯上升(p＜0.05).
　　十二、SG手術(shù)對小鼠脂肪組織caveolin-1、GLUT4、endocan及GRP78、IRE-1、XBP-1蛋

12、白表達(dá)的影響
　　Western blot檢測小鼠附睪脂肪組織caveolin-1、GLUT4、endocan(ESM-1)以及ERS標(biāo)志物GRP78，IRE-1及XBP-1蛋白相對表達(dá)量，提示術(shù)后脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度明顯緩解至接近正常(p＜0.01)。
　　十三、3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化及胰島素抵抗
　　誘導(dǎo)胰島素抵抗后，脂肪細(xì)胞攝取熒光葡萄糖量明顯減少。
　　十四、3T3-L1胰島素抵抗細(xì)胞GLUT4

13、、caveolin-1、ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的變化
　　通過qRT-PCR檢測3T3-L細(xì)胞誘導(dǎo)前后GLUT4、caveolin-1的mRNA表達(dá)變化，表明誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞胰島素抵抗后，細(xì)胞的ERS反應(yīng)明顯增高。
　　十五、caveolin-1干預(yù)的胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞的構(gòu)建與驗證
　　證實了Cav1-shRNA慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可明顯的下調(diào)caveolin-1的表達(dá)，即caveolin-1沉默的細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

14、>　　十六、caveolin-1沉默的脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取能力的改變
　　通過細(xì)胞攝取2-NBDG后，說明caveolin-1沉默明顯的降低了3T3-L1細(xì)胞對胰島素刺激下的葡萄糖攝取能力。
　　十七、caveolin-1過表達(dá)的脂肪細(xì)胞模型構(gòu)建與驗證
　　caveolin-1過表達(dá)的細(xì)胞模型構(gòu)建成功。
　　十八、caveolin-1過表達(dá)的脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取能力的改變
　　通過細(xì)胞攝取2-NBDG后，流式檢

15、測caveolin-1過表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)平均熒光強度的變化，與NC轉(zhuǎn)染組比，Cav-1 cDNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞平均熒光強度明顯增高，說明caveolin-1過表達(dá)明顯的升高了3T3-L1胰島素抵抗細(xì)胞對胰島素刺激下的葡萄糖攝取能力。
　　十九、干預(yù)caveolin-1表達(dá)對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞GLU4表達(dá)及ERS功能的影響
　　在3T3-L1胰島素抵抗脂肪細(xì)胞中轉(zhuǎn)染caveolin-1沉默的慢病毒質(zhì)粒(LV-Cav1-RNAi)72h

16、后，通過qRT-PCR和WB檢測了GLUT4的mRNA及蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明caveolin-1可負(fù)性調(diào)節(jié)ERS蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、SG術(shù)后短期內(nèi)db/db小鼠體重及攝食量明顯減低，血清TC，TG，LDL趨于正常，脂聯(lián)素水平上升，胰島素抵抗減輕。
　　2、SG術(shù)能夠上調(diào)db/db小鼠脂肪組織caveolin-1、GLUT4及endocan(ESM-1)mRNA和蛋白的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，增強組織對葡萄糖

17、的攝取轉(zhuǎn)運。
　　3、SG手術(shù)能夠抑制db/db小鼠脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白GRP78，IRE-1及XBP-1蛋白表達(dá)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白質(zhì)能力增強，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高負(fù)荷，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，從而增加脂肪組織對胰島素的敏感性，改善脂肪組織的胰島素抵抗。
　　4、3T3-L1前脂肪細(xì)胞可定向分化為成熟脂肪細(xì)胞，地塞米松可成功誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗。
　　5、誘導(dǎo)3T3-L1分化成熟及胰島素抵抗后，脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取減少，ca