Tregs在夏氏瘧原蟲(chóng)感染過(guò)程中分化特點(diǎn)和效應(yīng)研究.pdf

1、目的：
　　利用Plasmodium Chabaudi Chabaudi AS(P.c.chabaudi AS)感染BALB/c小鼠模型，通過(guò)抗CD25單克隆抗體（mAb，7D4克?。┰诟腥静煌瑫r(shí)間點(diǎn)消除Tregs，研究小鼠體內(nèi)Tregs的分化特點(diǎn)和作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示:Tregs感染后增殖明顯，功能分子表達(dá)增加;同時(shí)，觀察到不同時(shí)間點(diǎn)消除Tregs會(huì)出現(xiàn)不同的感染過(guò)程和結(jié)局。在感染早期，Tregs抑制Th1細(xì)胞應(yīng)答，加劇原蟲(chóng)負(fù)

2、荷;而感染中后期，Tregs可通過(guò)分泌IL-10抑制IL-6和TNF-α的分泌，控制免疫病理?yè)p傷。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及瘧疾感染模型構(gòu)建
　　6-8周齡、雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，包括對(duì)照組，感前消除組(-d3，-d17D4mAb)、感染早期消除組(d2，d47D4mAb)和感染高峰期消除組(d5，d77D4mAb)。其中感染前消除組于感染前3天(-d3)和感染前1天(-d1)經(jīng)腹腔給予抗CD25

3、mAb（1mg/鼠/次）;感染早期消除組小鼠于感染后d2和d4天經(jīng)腹腔注射相同劑量的7D4 mAb;同樣，感染高峰期消除組于感染后d5和d7天經(jīng)腹腔注射等劑量的7D4 mAb;對(duì)照組注射等劑量PBS。各組小鼠腹腔注射1×106 P.c.chabaudiAS感染的紅細(xì)胞(pRBC)，通過(guò)尾靜脈采血制備薄血膜，經(jīng)Giemsa染色，顯微鏡下觀察紅細(xì)胞感染率。
　　2、血清分離及脾細(xì)胞培養(yǎng)
　　于感染前(d0)和感染后d5、d8及d

4、11，麻醉小鼠，進(jìn)行無(wú)菌心臟采血。全血靜置后12000 rpm離心10分鐘(min)，吸取上清后-80℃保存?zhèn)溆?。無(wú)菌取出脾臟及肝臟，分別稱(chēng)重。肝脾指數(shù)的計(jì)算:肝/脾重量(mg)/小鼠體重(g)×100。稱(chēng)重后肝臟用4％多聚甲醛固定，用于HE染色。制備脾細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。用含10％胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整脾細(xì)胞濃度為1×107/ml。培養(yǎng)于24孔板中，每孔加脾細(xì)胞懸液500μl，于37℃、5％ CO2

5、條件下培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)上清，-80℃冰箱保存，待細(xì)胞因子檢測(cè)。
　　3、脾細(xì)胞熒光抗體染色
　　無(wú)菌取出d0、d5、d8和d11小鼠脾臟，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液。取100μL脾細(xì)胞懸液，預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體1μg，封閉30min。設(shè)陰性對(duì)照管及對(duì)應(yīng)單標(biāo)管。為染色CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞，每份樣品用抗-CD4-FITC mAb和抗-CD25-PE mAb進(jìn)行細(xì)胞表面染色，4℃孵育30min。每管加入0.25

6、ml固定透膜劑，4℃條件下作用1h。隨后加入抗-Foxp3-APC mAb進(jìn)行胞內(nèi)染色，4℃孵育30min。用0.5ml FBS/PBS重懸細(xì)胞，待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。抗-CD44、抗-CD69和抗-F4/80熒光抗體常規(guī)表面染色，T-bet需透膜劑透膜后胞內(nèi)經(jīng)抗-T-bet熒光抗體染色。IL-10和IFN-γ染色前需無(wú)菌條件下用PMA(25 ng/ml)、離子霉素(1μg/ml)以及brefeldin A(10μg/ml)共同刺激細(xì)胞，在

7、含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)5h(37℃)，之后常規(guī)染色。
　　4、Tregs的純化
　　在感染d0、d5、d8和d11，通過(guò)免疫磁珠分離技術(shù)分離CD4+CD25+(Tregs)和CD4+CD25-(Teffs)細(xì)胞。分離小鼠脾臟，正常無(wú)菌制備脾細(xì)胞懸液。利用EasySepTMMouse CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit，先通過(guò)陰選，分選出CD4+的脾細(xì)胞，之

8、后標(biāo)記抗-CD25的磁珠抗體，通過(guò)陽(yáng)選，分選出CD4+CD25+的細(xì)胞，剩余CD4+的脾細(xì)胞即為CD4+CD25-細(xì)胞。取5×104個(gè)分選后的細(xì)胞標(biāo)記抗-CD4及抗-CD25熒光抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Tregs及Teffs細(xì)胞的純度。
　　5、Real-time RT-PCR
　　純化后Tregs進(jìn)行Total RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。將cDNA作為模板，應(yīng)用特定引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用SYBR(@) Premix Ex Taq

9、TM試劑盒在ABI7500熒光PCR儀上進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。采用2-△△CT法計(jì)算各組之間的相對(duì)基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、P.c.chabaudi AS感染小鼠脾臟Tregs數(shù)量及活化程度
　　感染P.c.chabaudi AS后，BALB/c小鼠脾臟中的Tregs百分含量隨感染天數(shù)增加而出現(xiàn)顯著升高。Tregs在脾臟中的絕對(duì)數(shù)量于感染后d8達(dá)到峰值，隨后略有降低。與正常小鼠相比，感染后Tregs出現(xiàn)明顯的活

10、化，CD44+Tregs百分含量明顯增加，隨感染時(shí)間增加而顯著升高。而CD69+Tregs在感染后d5和d8也出現(xiàn)了明顯的升高（P＜0.05）。
　　2、P.c.chabaudi AS冀染小鼠脾臟Tregs的功能分子變化
　　與正常小鼠相比，感染P.c.chabaudi AS后，Tregs出現(xiàn)明顯的活化和增殖，同時(shí)其功能分子也出現(xiàn)相應(yīng)變化。結(jié)果顯示抑制分子CTLA-4(CD152)和TGF-β在Tregs中的mRNA的表達(dá)水

11、平在感染后d11出現(xiàn)一定升高，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。而IL-10的表達(dá)水平隨感染時(shí)間出現(xiàn)明顯的升高(P＜0.01)，在感染后d11升高的十分顯著。進(jìn)一步進(jìn)行IL-10的胞內(nèi)染色，發(fā)現(xiàn)CD4+FoxP3+IL-10+細(xì)胞的百分率在感染后d8和d11出現(xiàn)顯著的升高，該結(jié)果與mRNA表達(dá)結(jié)果相一致。
　　3、P.c.chabaudi AS感染小鼠中Tregs的體外功能研究
　　通過(guò)免疫磁珠分離技術(shù)，分離純化Tregs(

12、CD4+CD25+)和Teffs(CD4+CD25-)細(xì)胞，其中Tregs細(xì)胞的純度可達(dá)到93％左右。利用EdU增殖試劑盒，檢測(cè)Tregs對(duì)Teffs細(xì)胞的增殖抑制程度。結(jié)果顯示，EdU+細(xì)胞（增殖細(xì)胞）的數(shù)量在感染后出現(xiàn)明顯升高，而共培養(yǎng)組的增殖程度明顯被抑制。在感染后5天和8天抑制顯著(P＜0.01)。
　　4、不同感染時(shí)間點(diǎn)注射7D4 mAb后，對(duì)小鼠蟲(chóng)血癥和感染結(jié)局的影響
　　分別在感染后-d3和-d1、d2和d4、

13、d5和d7不同時(shí)間點(diǎn)注射7D4 mAb后，與正常感染小鼠相比，消除小鼠的Tregs出現(xiàn)明顯降低，消除率最高可達(dá)90％左右。消除維持時(shí)間一般為3-5天左右，3-5天后基本恢復(fù)到正常水平。
　　BALB/c對(duì)照組小鼠經(jīng)腹腔注射1×106 P.c.chabaudi AS感染的pRBC，感染后d5，外周血中可見(jiàn)瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞，隨后感染率迅速上升。感染后d8-9，紅細(xì)胞感染率達(dá)峰值(35.65％±3.32％)，之后蟲(chóng)血癥水平迅速下降，于

14、d19-20達(dá)到正常水平。小鼠于感染峰值后出現(xiàn)死亡，生存率在67％左右。
　　感染前消除組（-d3和-d1注射7D4 mAb）小鼠外周血中延遲出現(xiàn)感染紅細(xì)胞(d6-7)，感染率明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。并且，原蟲(chóng)血癥達(dá)峰值時(shí)間延遲至感染后d12-13。隨后，紅細(xì)胞感染率陡然下降，在感染后d20瘧原蟲(chóng)被徹底清除。小鼠出現(xiàn)死亡時(shí)間出現(xiàn)延后，但生存率與對(duì)照組相似。
　　感染早期消除組(d2和d4注射7D4 mAb)小鼠瘧原蟲(chóng)

15、感染的紅細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間和感染高峰期與對(duì)照組相似，但峰值明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。小鼠生存率略高于對(duì)照組。
　　感染高峰期消除組(d5和d7注射7D4mAb)小鼠瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間和感染高峰期與對(duì)照組相似，但峰值略低于對(duì)照組(P＜0.05)。但該組小鼠在感染d11左右全部死亡。
　　5、感染前消除Tregs小鼠脾細(xì)胞Th1型應(yīng)答水平
　　與正常感染小鼠相比，在感染后d5-8，感染前消除組小鼠的Th1細(xì)胞（CD

16、4+T-bet+IFN-γ+）百分率出現(xiàn)明顯升高(P＜0.05)。脾臟中巨噬細(xì)胞(F4/80+)的百分率也明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。血清中和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的分泌水平在d5-8天也均有增加。
　　結(jié)論：
　　1、P.c.chabaudi AS感染后，BALB/c小鼠脾臟Tregs明顯活化及增殖，功能分子IL-10表達(dá)明顯增加。小鼠脾臟Tregs的體外抑制功能明顯增強(qiáng)。
　　2、P.c.chabaudiA