Treg在夏氏瘧原蟲感染中調(diào)控Th應答效應機制研究.pdf

1、實驗目的:
　　 瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最為嚴重的寄生原蟲感染性疾病。2009年WHO瘧疾報告顯示,瘧疾流行于非洲、亞洲和拉丁美洲等的109個國家,全球約33億人口受到瘧疾威脅。每年有大約2.5億瘧疾病例發(fā)生,近百萬人死于瘧疾感染。瘧疾已成為全球最嚴重的三大公共衛(wèi)生問題之一。因此,有效瘧疾疫苗和抗瘧新藥的研制開發(fā)已經(jīng)成為當今世界迫切需要解決的重點課題,而瘧原蟲感染宿主機體應答的免疫學、分子生物學等綜合基礎研究是其重

2、要前提。
　　 在體內(nèi)建立適時、適度的保護性免疫應答有賴于免疫調(diào)節(jié)機制的精確調(diào)控。大量研究表明,調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory Tcell,Treg)在宿主免疫調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮舉足輕重的作用。在鼠瘧或流行區(qū)個體均已經(jīng)發(fā)現(xiàn)瘧疾感染會引起Treg數(shù)量變化。瘧疾流行區(qū)研究發(fā)現(xiàn),流行區(qū)個體對瘧疾感染的高抵抗性源于Treg功能性缺失。惡性瘧患者體內(nèi)Treg的活化與瘧原蟲高水平增殖密切相關。同時,間日瘧原蟲感染中Treg數(shù)量增高與原蟲負荷

3、增加有關。但同時有研究證實Treg不能對瘧疾急性期感染發(fā)揮調(diào)控作用。Hiseada等多個研究小組證實Treg能夠輔助原蟲逃避宿主免疫監(jiān)視,Treg可能是宿主對原蟲發(fā)生免疫耐受的主要原因。但近期有研究顯示,消除Treg將導致宿主貧血、原蟲負荷增加和病理性炎癥應答等不良癥狀出現(xiàn)。因此,Treg在瘧疾感染中的作用尚待深入研究。
　　 我們前期的研究顯示,致死型約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XL,P.y17XL)感染中

4、,BALB/c小鼠的易感性與體內(nèi)Treg的活化密切相關。DBA/2小d鼠在P.y17XL和致死型夏氏瘧原蟲(Plasmodium chabadudi chabadui AS,.P.c chabadui AS)感染中呈現(xiàn)截然相反的感染結局。為深入探討Treg在瘧疾感染中的作用地位,本研究動態(tài)觀察了P.c chabadui AS感染DBA/2小鼠體內(nèi)Treg活化特點,系統(tǒng)研究了P.cchabaudi AS感染中Treg對Th免疫應答的調(diào)控效

5、應及其相關機制,以期進一步明確Treg在瘧疾感染過程中的作用地位。
　　 實驗方法:
　　 1、實驗動物及其模型構建
　　 6-8周齡、雌性DBA/2小鼠,經(jīng)腹腔分別感染1×106 P.c chabaudi AS寄生的紅細胞(pRBC),構建不同的實驗動物模型。
　　 2、體內(nèi)CD25+T細胞消除
　　 DBA/小鼠于感染前d1、感染后d1和d3,經(jīng)腹腔給予抗CD25mAb(1mg/鼠/次),抗C

6、D25mAb來自經(jīng)Hi-Trap Protein G柱純化的7D4雜交瘤細胞株接種的裸鼠腹水。與實驗組對應同一時間點,對照組DBA/2小鼠經(jīng)腹腔給予同體積的1×PBS。
　　 3、脾細胞熒光抗體染色
　　 無菌取出感染前(d0)和感染后d3、5、8、10小鼠脾臟,常規(guī)制備脾細胞懸液。取0.1ml脾細胞懸液,預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體1μg封閉30min。設陰性對照管及對應單標管。為染色CD4+CD25+Foxp3+細胞

7、,每份樣品同時用抗-CD4-FITCmAb和抗-CD25-PE mAb進行細胞表面雙色標記,4℃孵育30min。每管加0.25ml固定透膜劑,4℃孵育1h。再加入抗-Foxp3-APC mAb進行胞內(nèi)染色,4℃孵育30min。用0.5ml FBS/PBS重懸細胞,待流式細胞儀進行檢測。為染色胞內(nèi)Ig表達水平,每份樣品同時用抗-B220-PerCP和抗-CD138-PE mAb進行細胞表面雙色標記,4℃孵育30min。每管加0.25mlB

8、D固定透膜劑,4℃孵育1h。再加入抗-IgG1-FITC或抗-IgG2a-FITC mAb進行胞內(nèi)染色,4℃孵育30min。用0.5ml FBS/PBS重懸細胞,待流式細胞儀進行檢測。
　　 4、IFN-γ和TNF-α定量檢測
　　 采用ELISA方法,分別檢測經(jīng)培養(yǎng)48h脾細胞上清IFN-γ和TNF-α分泌水平。酶標儀測定450nm處OD值。結果以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線,應用SoftMax Pro4.3.1LS

9、軟件分析,計算細胞因子含量(pg/ml)。
　　 5、NO水平檢測
　　 Griess方法檢測經(jīng)培養(yǎng)48h脾細胞上清中NO2-水平。計算其含量(μM)。
　　 6、CD4+T細胞凋亡水平檢測
　　 常規(guī)收集脾細胞,調(diào)細胞濃度1×105個/管。設陰性對照管和單標管。每管加抗-CD4-FITC mAb進行細胞表面染色,4℃孵育30min。再加入5ul7-AAD和5ulPE-Annexing-V原液,輕柔震動,

10、37℃避光孵育15分鐘。每管加0.5ml FBS/PBS,輕柔震動,待流式細胞儀進行檢測。
　　 7、統(tǒng)計學分析
　　 應用SPSS11.5統(tǒng)計學分析軟件,Student's test比較分析組內(nèi)和組間均值的差異。P小于或等于0.05為差異顯著。
　　 實驗結果:
　　 1、P.c chabaudi AS感染小鼠原蟲血癥水平和生存率
　　 DBA/2小鼠腹腔接種1×106 P.c chabaudi

11、 AS寄生的紅細胞(pRBC)后,于感染后d5在外周血中可見瘧原蟲感染的紅細胞,隨后紅細胞感染率迅速上升。在感染后d5-7期間,紅細胞感染率從1％升至28％。在感染后d8-9,紅細胞感染率達到峰值(40.3％)。DBA/2小鼠于感染峰值后全部死亡。瘧原蟲感染的紅細胞在Treg消除鼠外周血中延遲出現(xiàn)(d6-7),紅細胞感染率在達峰值前(d5-7)明顯低于對照組。并且,原蟲血癥達峰值(37.5％)時間延遲至感染后d10。隨后,紅細胞感染率陡

12、然下降,在感染后d10-15從35％降至3％,在感染后d20瘧原蟲被徹底清除,小鼠生存期明顯延長。
　　 2、P.c chabaudi AS感染小鼠CD4+CD25+Foxp3+細胞數(shù)量
　　 與na(I)ve小鼠相比,在感染后d5-10,DBA/2小鼠感染P.c chabaudi AS后Foxp3表達水平明顯增加。為此,我們以na(I)ve小鼠表達Foxp3熒光強度為標準,Foxp3表達熒光強度高于103以上者視為Fo

13、xp3hi。與na(I)ve小鼠相比,在感染后d5-10,DBA/2小鼠CD4+CD25+Foxp3+細胞總數(shù)增加了2-5倍,CD4+CD25+Foxp3hi細胞總數(shù)增加了約6-30倍。CD4+CD25+Foxp3hi占CD4+T細胞百分含量比從初始0.1％增至峰值2％。在感染后d5-10,CD4+CD25+Foxp3hi細胞比CD4+CD25+Foxp3+細胞的增殖幅度明顯。
　　 Treg消除鼠感染P.c chabaudi

14、AS后CD25表達一過性短暫下調(diào),隨后出現(xiàn)明顯回升。在感染后d8,Treg消除組脾臟CD4+CD25+Foxp3+細胞百分含量與對照組無明顯差異。相比,Treg消除組Foxp3表達水平明顯降低且維持較長時間。與對照組相比,Treg消除組從感染后d3,Foxp3表達有降低趨勢。在感染后d5-8明顯下降,于感染后d10,Foxp3表達回升至對照組水平。在感染后d3,Treg消除組脾臟CD4+CD25+Foxphi細胞總數(shù)是對照組的30％,隨

15、著對照組CD4+CD25+Foxphi細胞總數(shù)的增加,Treg消除組CD4+CD25+Foxphi細胞所占其比例進一步降低。在對照組CD4+CD25+Foxphi細胞總數(shù)達峰值時,Treg消除組CD4+CD25+Foxphi細胞總數(shù)是對照組的15％。
　　 3、P.c chabaudi AS感染小鼠脾細胞培養(yǎng)上清前炎癥因子水平
　　 為明確Treg對Th1型免疫應答的影響,我們檢測脾細胞培養(yǎng)上清中前炎癥細胞因子水平。與n

16、a(I)ve小鼠相比,DBA/2小鼠感染p.c chabaudi AS后d3-5,前炎癥細胞因子IFN-γ和TNF-α明顯增加,且巨噬細胞活化特征性標志NO水平亦明顯增加。與對照組相比,Treg消除組于感染后IFN-γ、TNF-α和NO的分泌水平進一步增強。
　　 4、P.c chabaudi AS感染小鼠脾臟漿細胞數(shù)量
　　 為確定Treg是否調(diào)控由Th2細胞介導的體液免疫應答,我們檢測了B220lowCD138+漿細

17、胞、胞內(nèi)合成IgG1(iIgG1+)和胞內(nèi)合成IgG2a(ilgG2a+)的細胞數(shù)量。與對照組相比,Treg消除組脾臟B220lowCD138+總漿細胞數(shù)量在感染后d8出現(xiàn)一過性降低,在感染后d10恢復至對照組水平。在感染后d10,Treg消除組脾臟iIgG1+和iIgG2a+細胞總數(shù)與對照組相比無明顯差異。
　　 5、P.c chabaudi AS感染小鼠脾臟IL-12+細胞數(shù)量
　　 與na(I)ve小鼠相比,在感染

18、后d3-5,DBA/2小鼠胞內(nèi)合成IL-12(IL-12+)的細胞總數(shù)增加。與對照組相比,在感染后d3-5,Treg消除組IL-12+細胞總數(shù)增加更為明顯。
　　 6、P.c chabaudi AS感染小鼠脾臟CD4+T細胞凋亡水平
　　 與對照組相比,在感染后d3-5,Treg消除組的CD4+T細胞凋亡數(shù)量明顯降低。
　　 7、P.c chabaudi AS感染小鼠脾細胞培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β水平

19、>　　 與對照組相比,在感染后d5-8,Treg消除組脾細胞上清IL-10水平明顯升高。而TGF-β水平變化趨勢與對照組相比無明顯差異。
　　 結論:
　　 1、P.c chabaudi AS感染導致DBA/2小鼠脾臟CD4+T細胞Foxp3表達增高。擴增的CD4+CD25+Foxp3hi細胞與原蟲負荷密切相關,明顯影響著瘧疾感染的進程和最終結局。
　　 2、P.c chabaudi AS感染早期,CD4+CD