睪酮在巨噬細(xì)胞及其杜氏利什曼原蟲感染中的作用機(jī)制.pdf

1、雄激素可以促進(jìn)多種疾病的發(fā)生發(fā)展,大量臨床及流行病學(xué)資料顯示,男性比女性更易感染細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原微生物,其具體機(jī)制不詳,可能與雄激素抑制機(jī)體免疫有關(guān).黑熱病是由杜氏利什曼原蟲引起的一種致死性寄生蟲病,杜氏利什曼原蟲寄生于宿主的巨噬細(xì)胞中,從而引起一系列的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的病變.闡明雄激素在黑熱病中的作用機(jī)制將為疾病的預(yù)防和治療起重要的指導(dǎo)作用,我們?cè)隗w外分離培養(yǎng)杜氏利什曼原蟲和骨髓巨噬細(xì)胞,試圖從分子水平探索雄激素對(duì)杜氏利什曼原

2、蟲細(xì)胞內(nèi)感染的調(diào)控機(jī)理. 本實(shí)驗(yàn)使用L929細(xì)胞條件培養(yǎng)基作為巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-cloning stimulatory factor,M-CSF)來(lái)源,誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化.原代培養(yǎng)5天后,利用熒光標(biāo)記的巨噬細(xì)胞特異性F4/80抗體,通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)體系中巨噬細(xì)胞的純度進(jìn)行分析,同時(shí)分選出F4/80抗原呈陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞,此即為骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived ma

3、crophages,BMMs).首先用.Annexin V-FITC/PI雙染法觀察不同處理時(shí)間睪酮對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響.然后提取巨噬細(xì)胞的總蛋白,利用Western blotting方法分析睪酮處理組和杜氏利什曼原蟲感染組巨噬細(xì)胞中ERK1/2、p38MAPK和JNK/SAPK基因的激活狀況,并用特異性MAPK(有絲分裂原激活蛋白激酶)抑制劑進(jìn)一步檢測(cè)MAPK信號(hào)途徑在杜氏利什曼原蟲感染巨噬細(xì)胞中的可能作用.為探討雄激素在巨噬細(xì)胞中的

4、作用機(jī)制,采用RT-PCR、Western blotting、FCM和CLSM等方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中是否有雄激素受體的表達(dá),同時(shí)觀察不能自由透過(guò)細(xì)胞膜的testosterone-BSA(T-BSA)分子在巨噬細(xì)胞膜表面的結(jié)合狀況,最后測(cè)定巨噬細(xì)胞中游離鈣離子濃度. 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雄激素可以誘導(dǎo)骨髓巨噬細(xì)胞凋亡,并伴有Fas,FasL和Caspase-8凋亡相關(guān)基因的表達(dá)增加,我們推測(cè)雄激素是通過(guò):Fas/FasL途徑誘導(dǎo)骨髓巨噬細(xì)胞凋

5、亡的.而感染了杜氏利什曼原蟲后的細(xì)胞凋亡數(shù)則明顯減少,凋亡在寄生蟲和宿主相互作用中具有重要意義,寄生蟲會(huì)因抑制宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡而達(dá)到維持感染和蟲荷的目的. 性激素對(duì)靶細(xì)胞的作用可以通過(guò)兩種不同途徑來(lái)實(shí)現(xiàn):一種是經(jīng)典途徑即基因組途徑,性激素通過(guò)自由擴(kuò)散進(jìn)入胞漿并與相應(yīng)受體結(jié)合,活化的受體二聚體與HRE特異結(jié)合,啟動(dòng)下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄;另一種途徑是近幾年來(lái)逐漸引起人們關(guān)注的非基因組效應(yīng),其特點(diǎn)是作用快,不需進(jìn)入細(xì)胞即可起效,隨后也可由

6、于細(xì)胞的內(nèi)吞作用而進(jìn)入胞內(nèi).本研究采用多種方法試圖在巨噬細(xì)胞中尋找雄激素的受體,包括RT-PCR、Western-blotting、FCM以及CLSM等,然而,這些方法都不能提供有說(shuō)服力的證據(jù)說(shuō)明巨噬細(xì)胞中存在雄激素的細(xì)胞內(nèi)受體,很顯然,雄激素在巨噬細(xì)胞中的作用機(jī)理不能夠用傳統(tǒng)的激素.細(xì)胞內(nèi)受體模式來(lái)解釋.相反,使用不能通過(guò)細(xì)胞膜的雄激素-BSA,我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的表面存在有睪酮的結(jié)合位點(diǎn),并且激素結(jié)合以后能迅速引起巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子

7、濃度增加,細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加主要是由細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流而不是細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放引起的. 我們發(fā)現(xiàn)雄激素可以增加杜氏利什曼原蟲對(duì)巨噬細(xì)胞的感染率與感染水平.寄生蟲對(duì)宿主細(xì)胞正常信號(hào)傳導(dǎo)途徑的干擾是其在胞內(nèi)生存的必要條件,蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過(guò)程是生物體內(nèi)普遍存在的信息傳導(dǎo)調(diào)節(jié)方式,幾乎涉及所有的生理及病理過(guò)程.MAPK是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,由于其性質(zhì)的保守性和分布的廣泛性,在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中占有極其重要的地位.大量實(shí)

8、驗(yàn)室證據(jù)表明,病原體感染可以干擾宿主細(xì)胞的MAPK信號(hào)途徑.在本實(shí)驗(yàn)中,杜氏利什曼原蟲感染快速、可逆的激活了骨髓巨噬細(xì)胞的p38 MAPK信號(hào)分子,而對(duì)MAPK家族的ERK1/2和JNK/SAPK活性并沒有影響.我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),雄激素本身對(duì)MAPK信號(hào)分子的活性沒有影響,有趣的是,雄激素卻可以抑制杜氏利什曼原蟲對(duì)p38 MAPK的激活作用.使用p38 MAPK抑制劑SB203580可以抑制杜氏利什曼原蟲對(duì)p38 MAPK的激活作用,并進(jìn)

9、一步發(fā)現(xiàn)SB203580亦可增加杜氏利什曼原蟲對(duì)巨噬細(xì)胞的感染率,說(shuō)明p38MAPK信號(hào)途徑在杜氏利什曼原蟲感染杜氏利什曼原蟲中起重要作用. 睪酮可誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣離子增加,而鈣離子是一種重要的信號(hào)分子,可啟動(dòng)一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性,其在細(xì)胞內(nèi)水平的高低影響許多細(xì)胞功能.我們預(yù)先用鈣鰲合劑BAPTA處理細(xì)胞,再加入睪酮和杜氏利什曼原蟲,發(fā)現(xiàn)在BAPTA處理組中,睪酮不能抑制杜氏利什曼原蟲p38 MAPK的激活作用,表明其

10、抑制作用是由鈣離子介導(dǎo)的. 根據(jù)非基因組效應(yīng)的特點(diǎn)和骨髓巨噬細(xì)胞內(nèi)未檢測(cè)到雄激素經(jīng)典胞內(nèi)受體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們推測(cè),雄激素增加了杜氏利什曼原蟲對(duì)巨噬細(xì)胞的感染,其啟動(dòng)過(guò)程可能與雄激素膜受體途徑有關(guān).雄激素通過(guò)膜受體途徑抑制了杜氏利什曼原蟲對(duì)宿主細(xì)胞p38 MAPK的激活作用,進(jìn)而增加了原蟲的感染.膜受體途徑為我們進(jìn)一步探討雄激素如何發(fā)揮其對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用,雄激素與黑熱病間的關(guān)系,以及闡述類固醇激素的分子作用機(jī)理及其基因調(diào)控具有