硝唑尼特對(duì)杜氏利什曼原蟲的藥效學(xué)及一般毒性研究.pdf

1、杜氏利什曼原蟲(Leishania donovani,L.d)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的鞭毛蟲，可感染人、哺乳動(dòng)物和爬行動(dòng)物等，引起人畜共患的利什曼原蟲病（Leishmaniasis）又稱黑熱病。該病呈世界范圍流行，目前全世界黑熱病患者超過1200萬，另外有3.67億人面臨著感染威脅11]。20世紀(jì)50年代，黑熱病曾在我國長江以北地區(qū)廣泛流行，是我國人群中五大寄生蟲病之一。
　　 傳統(tǒng)治療藥物有多價(jià)銻類化合物、噴他脒和兩性霉素B等，

2、然而近年來對(duì)多價(jià)銻劑的耐藥性日益嚴(yán)重，極大的限制了它們的應(yīng)用，另外，兩性霉素B常導(dǎo)致中毒性腎損害、過敏反應(yīng)、低血鉀、發(fā)熱和心臟毒性等，而噴他脒又存在療程長、復(fù)發(fā)率高、用藥不方便等缺陷[2]。因此，研究一種新的抗黑熱病藥物已經(jīng)迫在眉睫。
　　 硝唑尼特(Nitazoxanide,NTZ)是一種硝噻柳酸酰胺的衍生物。由Romark實(shí)驗(yàn)室于1976年首次報(bào)道，化學(xué)名稱為苯酚乙酸酣3]。2002年美國FDA批準(zhǔn)其液體制劑用于治療隱孢子蟲

3、病和由腸賈第鞭毛蟲所致1-11歲的兒童腹瀉[4]。另外，大量實(shí)驗(yàn)研究表明其不但有抗多種寄生蟲活性，同時(shí)還具有抗細(xì)菌、抗病毒活性[5]，目前，NTZ用于治療艱難梭狀芽胞桿菌的相關(guān)疾病、輪狀病毒引起的胃腸炎和丙型肝炎已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段[鋤]。但至今尚未見其用于杜氏利什曼原蟲的研究報(bào)道，而且對(duì)于NTZ的毒理學(xué)研究公開報(bào)道較少，因此，我們選用硝唑尼特對(duì)厶威生行藥效活性試驗(yàn)，以觀察該藥對(duì)L.d的驅(qū)殺效果，同時(shí)進(jìn)行了硝唑尼特的一般毒性研究，以初步

4、評(píng)價(jià)其安全性，為該藥的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 體外試驗(yàn)應(yīng)用鏡下觀察和四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，檢測六個(gè)劑量組(200ug/mL、l00l,tg/mL、50~g/n1L、25gg/mL、12.5~,g/mL和6.25gg/mL)的NTZ分別作用48h和72h后對(duì)L.d前鞭毛體的藥效活性，以3pg/mL的兩性霉素B為陽性對(duì)照組，陰性對(duì)照組加入等量藥物溶劑DMSO，空白對(duì)照組不做任何處理。結(jié)果顯示，藥物作用48h后，以鏡下觀察

5、和MTT比色法檢測上述各濃度NTZ的抑蟲率分別為95.85％、87.17%、66.81%、53.10%、42.45%、28.13%和94.81%、87.23%、59.26%、45.98%、38.80%、25.14%,與陰性對(duì)照組（1.12%和0.97%）比較有顯著差異(P<0.05)，另外，200ug/mL藥物組的抑蟲率與陽性對(duì)照組（99.81%和99.87%）比較無顯著差異(P>0.05)；硝唑尼特作用72h后兩種方法檢測的各濃度藥物

6、抑蟲率均有一定的提高，分別為98.69%、90.52%、73.56%、54.74%、45.86%、31.22%和98.75%、91.08%、68.53%、55.79%、42.67%、31.80%，與陰性對(duì)照組（1.76%和1.62%）比較有顯著差異(P<0.05)，同樣2001sg/mL藥物組與陽性對(duì)照組作用效果相似，與其抑蟲率（99.95%和99.96%）無顯著性差異（p>0.05）。同時(shí)，本試驗(yàn)采用姬母薩染色實(shí)驗(yàn)和電鏡實(shí)驗(yàn)觀察了藥物

7、對(duì)蟲體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果，200ug/mL硝唑尼特作用72h后，吉姆薩染色可見L.d前鞭毛體嚴(yán)重變形，有部分變成蟲體碎片，鞭毛脫落，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，核消失，動(dòng)基體不完整，與陽性對(duì)照組相似；100ug/mL和501sg/mLNTZ組的蟲體出現(xiàn)鞭毛脫落，動(dòng)基體不完整，胞膜不清晰；而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組蟲體形態(tài)基本無變化，均呈長梭形，并排成菊花狀，胞膜、核、動(dòng)基體、鞭毛完整、清晰。電鏡下觀察，可見藥物試驗(yàn)組蟲體細(xì)胞基質(zhì)紊亂，有凝聚塊，細(xì)

8、胞核基質(zhì)出現(xiàn)空斑，部分細(xì)胞核膜破裂，線粒體膜消失：空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組蟲體結(jié)構(gòu)完整、核清晰。
　　 體內(nèi)試驗(yàn)應(yīng)用有限稀釋法、熒光定量PCR法和肝組織病理切片檢測三個(gè)劑量組(400mg/mL、200mg/mb和100mg/mL) NTZ對(duì)感染厶利、鼠的保護(hù)效果，試驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組比較400mg/kg/d的NTZ連續(xù)治療10d能明顯減少攻蟲小鼠肝、脾內(nèi)的蟲體負(fù)荷，減蟲率均大于90%，200mg/kg,100mg/kg藥物組

9、同樣表現(xiàn)出一定的抑蟲效果，并且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)相關(guān)性。各組小鼠肝臟的HE染色結(jié)果顯示，400mg/kg/d的NTZ對(duì)小鼠肝臟具有很好的保護(hù)效果，能明顯減少肝細(xì)胞壞死、腫脹和胞核崩解，與陽性對(duì)照組比較僅表現(xiàn)出匯管區(qū)靜脈輕度充血和少量蛋白樣物質(zhì)析出。另外，本試驗(yàn)建立了利什曼原蟲的熒光定量PCR檢測方法，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，此方法可為黑熱病的實(shí)時(shí)監(jiān)控和防治提供非常有效的檢測技術(shù)手段。
　　 硝唑尼特

10、一般毒性試驗(yàn)按照農(nóng)業(yè)部《新獸藥一般毒性試驗(yàn)技術(shù)要求》進(jìn)行。小鼠經(jīng)口灌服中毒劑量的硝唑尼特后，出現(xiàn)活動(dòng)減弱，被毛濕潤，精神萎靡，有的陣發(fā)性抽搐，有的呈游泳狀緩慢爬行，部分小鼠出現(xiàn)腹瀉，食欲減低，體重減輕，死亡時(shí)間多在給藥后ld至3d內(nèi)，死亡動(dòng)物無性別差異，剖檢發(fā)現(xiàn)腹腔粘膜呈土黃色，腸壁變薄，腸管內(nèi)有褐色水樣液體，呈出血和壞死性腸炎病變，存活動(dòng)物在2d至6d后逐漸恢復(fù)正常。灌服溶劑玉米油的小鼠生長良好。經(jīng)計(jì)算，NTZ對(duì)小鼠口服LDso為6.