一般毒性作用

1、第六章一般毒性作用General toxic effects,一. 概述 二. 急性毒性作用 三. 局部毒性作用 四. 短期、亞慢性和慢性毒性作用 （蓄積性與耐受性）,一般毒性： 1. 急性毒性 （acute toxicity） 2. 局部毒性 （local toxicity） 3. 亞急性毒性 （su

2、bacute toxicity） 4. 亞慢性毒性 （subchronic toxicity） 5. 慢性毒性 （chronic toxicity）,,,重復(fù)暴露毒性,特殊毒性： 1.致癌 （carcinogenicity） 2.致突變 （mutation） 如：小鼠微核試驗

3、（mouse micronucleus test） 小鼠顯性致死試驗（mouse dominant lethal test） 大鼠染色體畸變試驗（rat chromosome aberration test） 3.致畸 （teratogenesis） 4.生殖發(fā)育毒性 （reproductive and development

4、al toxicity） 5. 藥物依賴性 （drug dependence),一、一般毒性作用概念和意義 一般毒性評價主要目的： 1. 確定受試物毒作用表現(xiàn)與性質(zhì)； 2. 確定受試物毒作用的劑量與反應(yīng)關(guān)系； 獲得的參數(shù)有：LD50、LOAEL、NOAEL 3. 確定毒作用靶器官； 4. 評價毒性損害的可逆性； 5. 了解化學(xué)藥物

5、毒作用的影響因素等。,第一節(jié) 概 述,二、一般毒性試驗的動物選擇 （一）實驗動物選擇 1.物種 選擇原則： ⑴ 與人體生物學(xué)特征相似的動物； ⑵ 自然壽命不太長的動物； ⑶ 易于飼養(yǎng)與實驗操作的動物； ⑷ 經(jīng)濟并易于獲得的動物。 （一般選擇兩個物種進行試驗）,,2.品系 一般在毒理學(xué)系列研究中應(yīng)使用同一品系。 3.級別（質(zhì)量） Ⅱ

6、級（清潔級）或Ⅲ級（SPF級）的動物 4.性別 受試物毒性如果有性別差異，應(yīng)選擇敏感的性別，若沒有應(yīng)選擇兩種性別進行試驗（♂/♀各半）。 5.年齡與體重 急性試驗-選擇成年動物；慢性試驗-剛斷乳動物。同一性別動物的起始體重差異≯平均體重20%。 6.生理與健康狀況 不選擇懷孕、哺乳其動物，須選擇健康動物（健康觀察期5-7天）。,,（二）染毒方式 選擇原則： 一般

7、選擇受試物實際與人接觸的途徑。 1.呼吸道染毒 有：氣管注入染毒 吸入染毒（靜式與動式兩種） 2.消化道染毒 有：灌胃法、喂飼法和膠囊法。 3.經(jīng)皮染毒 有：表皮涂藥、浸尾法。 4.注射途徑 有：靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)等。,,,一、急性毒性概念 是指1次接觸或24小時內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物在短期內(nèi)所產(chǎn)生的健康損害作用和致死效應(yīng)。

8、 實驗效應(yīng)觀察期：2周。 24小時多次染毒： 毒性很低或溶解度很低的受試物。 一般規(guī)定：≯3次/24小時，每次間隔4小時以上。,第二節(jié) 急性毒性作用,二、急性毒性試驗的目的 1.評價急性毒性大小 求出LD50、LD100、LD01、LD0或MTD、LOAEL、NOAEL等。 2.了解急性毒性特征（中毒癥狀與體征） 3.為亞急性、亞慢性、慢性、致癌等試驗提供劑量設(shè)置

9、的依據(jù)。 4.為毒作用機制研究提供初步線索。,,用LD50作為劑量參考依據(jù)的毒性試驗,試驗類別 劑量設(shè)組要求 蓄積毒性試驗 1/20-1/5 LD50范圍設(shè)組 亞慢性試驗 1/20-1/5 LD50作最高劑量 慢性(致癌)試驗 1/10 LD50作最高劑量,,,,三、急性毒性試驗方法要點 （一）經(jīng)典急性毒性試驗 （即傳

10、統(tǒng)LD50法）,基本要求:（OECD） 1.檢疫觀察3-5d，成年健康動物（大鼠首選）； 2.5-7個劑量組，每組10只動物以上（♀/♂各半）； 3.劑量組距合適，一般為等比級數(shù)； 4.給藥途徑盡量與實際接觸一致； （隔夜禁食（12-14h），給藥后再禁食3-4小時） 5.毒性觀察期至少2周以上，每天觀察1次。,LD50計算方法： ①曲線擬合法 （概

11、率單位法或Bliss法） ②插值法 累積法 寇氏法 移動平均法 霍恩(Horn)法-查表法 Weil查表法等,劑量設(shè)置依據(jù)： ①參考同系物或類似物的急性毒性資料； ②最大耐受致死量（LD0）測定； WHO規(guī)定給藥劑量：經(jīng)口 5000mg/kg 經(jīng)呼吸道 5000ppm

12、 經(jīng)皮膚 2000mg/kg ③預(yù)試驗測定致死劑量范圍 即死亡率從0%～100%（10%～90%) -Lork法（改良法的組距為1.3-1.5） -組距法,改良Lork簡化劑量設(shè)計方案,,,公式： i =（lgLD90-lgLD10）/（n-1） 或 i=（lgLD100-lgLD0）/（n-1） 式中：i-為組距

13、 n-為設(shè)計的劑量組數(shù),組距法確定各組劑量,假定某化學(xué)藥物L(fēng)D100為2000mg/kg, LD0為500mg/kg,設(shè)6個劑量組，各染毒組的劑量是多少？ 1.按公式求出對數(shù)劑量組距（I） 公式： I=（lgLD100-lgLD0）/（n-1) =（lg2000-lg500）/(6-1) =（3.301-2.699）/5 =0.

14、120 2.確定各組實際劑量（見下表）,實例,某化學(xué)藥物急性毒性試驗劑量設(shè)置,組別 劑量對數(shù) 劑量（mg/kg） 1 2.701 502.3 2 2.821 662.2

15、 3 2.941 873.0 4 3.061 1150.8 5 3.181

16、 1517.1 6 3.301 2000.0 注：劑量對數(shù)組距=0.12，劑量組間的等比級數(shù)=1.318,,,,,,,,,,,,要求： ① 5～6個劑量組，每組動物數(shù)相等； ② 死亡率呈正態(tài)分布； ③ 最低劑量組死亡率＜

17、20%； 最高劑量組死亡率＞80%， ④ 各組劑量呈等比級數(shù)（一般為1.2-1.5）。特點： ① 計算結(jié)果簡便（按公式計算） ② 精確度高,1.改良寇氏 (Karber)法 –點斜法,LD50(或LC50)計算,公式： lgLD50＝Xk－i(?p－0.5) pq S＝i ?

18、n LD50的95%可信限＝(LD50±1.96 S),LD50計算公式：,,,,,,,式中： m-lgLD50; i-組間對數(shù)劑量差值； Xk-最大劑量的對數(shù)值； q-存活率（q=1-p）； ∑p-各劑量組死亡率總和； n-每組動物數(shù)。,應(yīng)用實例,公式：,lgLD50 =1.4961-0.08(2.3-0.5) =1.3521,,,lg

19、LD50及其95%可信限為1.3521±1.96×0.0213=1.3104~1.3938 LD50及其95%可信限為22.5 mg/kg（20.44~24.76 mg/kg）,,,要求： ① 4個劑量組，每組動物數(shù)相等（4只或5只） ② 雌雄分開試驗 ③ 每組劑量為固定倍數(shù)遞增（2.15倍，3.16倍） 特點： ① 動物用量少 ② 結(jié)果查表可得（查表可得L

20、D50及95%可信限范圍） ③ 精確度不高,2.霍恩(Horn)法 – 又稱劑量遞增法,,霍恩(Horn)法查表-2.15倍組距,,例如：全活-全死劑量范圍為200-1500mg/kg 劑量組選擇215,464,1000,2150 (t=2),,,霍恩(Horn)法查表-3.16倍組距,,例如：全活-全死劑量范圍為180-3500mg/kg 劑量組選擇100,316,1000,3160 (t=2),,(

21、二）急性毒性替代法 “3R”原則要求： 替代（Replacement） 減少（Reduction） 優(yōu)化（Refinement） 常見的替代法有： 1.限量試驗（limit test） 2.固定計量法（fixed dose method） 3.急性毒性分級法（acute toxic class method）

22、4.上下法（up and down procedure）-序貫法,,使用條件： 受試物急性毒性很低時可采用此法。方法要求： ① 受試動物一般為嚙齒類動物； ② 24小時內(nèi)多次給予受試物； ③ 20只動物，雌雄各半； ④ 給予最大劑量，一般為10000mg/kg； ⑤ 毒性觀察期14天；毒性評價： LD50＞給藥劑量（mg/kg）,1.限量試驗,,,方法要求：（實際上是一種非死

23、亡毒性評價） ① 固定劑量：5、50、300、2000mg/kg； ② 預(yù)試驗：用單性別1只動物循序進行，接受試驗前后的2只動物間隔24小時。如一個劑量無中毒表現(xiàn)，其上個劑量動物死亡，需在中間插入劑量進行試驗； ③ 正式試驗：根據(jù)預(yù)結(jié)果，取5只動物進行試驗； ④ 限量試驗：如果2000mg/kg預(yù)試驗和正式試驗均不出現(xiàn)中毒表現(xiàn)，試驗終止，為未觀察到毒性(U) 。 ⑤ 若正式試驗5mg/kg出現(xiàn)中毒

24、表現(xiàn)或死亡，試驗終止，可定為高度(T+)。 結(jié)果判斷（OECD）： 高毒(T+)、有毒(T)、有害(H)、未觀察到毒性(U)。,2.固定劑量法,FD法急性毒性分級選定：,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3.急性毒性分級法,注：按全球化學(xué)品分類及標(biāo)簽協(xié)調(diào)制度（GHS）標(biāo)準(zhǔn)評價定級,,,,要求： 先以一個劑量進行一個動物試驗，如動物死亡，則以下一個較小劑量試探，若仍動物死亡則以下一個更小劑量試探；如動物存活，則以較大劑量

25、試探，依次類推，最終按公式計算LD50值。 死亡觀察為48小時，存活動物觀察14天。特點： ① 節(jié)省動物（一般6-10只動物或以上）； ② 適用于毒性反應(yīng)快速的化學(xué)藥物。,4.序貫法（ - 又稱上-下法）,序貫法實驗,計算公式：,式中： n-使用動物總數(shù)； x-每個劑量組的劑量； f-每個劑量組動物數(shù)。,應(yīng)用實例,,,,,,,,,（三）急性毒作用觀察 觀察記錄內(nèi)容： ①中

26、毒癥狀（觀察2周，記錄癥狀發(fā)生的時間、程度和持續(xù)時間等）； ②試驗前后記錄體重（每周至少稱體重1次）； ③死亡記錄（死亡數(shù)用于計算LD50）； ④大體解剖與病理學(xué)檢查等。,,四、急性毒性分級,WHO急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)：,,國內(nèi)健康相關(guān)產(chǎn)品毒性分級,,,,GHS化學(xué)品急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)（2002）,,≥第4級上限值,,注：GHS-全球化學(xué)品分類及標(biāo)簽協(xié)調(diào)制度 （Globally Harmonized Syste

27、m of Classification and Labeling of Chemicals ）,,LD50評價問題 1.毒性大小比較 LD50值較大者的95%可信限的下限＞LD50值較小者的95%可信限的上限。前者的毒性小于后者。 如果可信區(qū)間存在重疊，按公式進行t檢驗： 公式： 2.劑量-反應(yīng)曲線斜率比較 （可分析毒性特征） 3. LD50值表示,表示LD50

28、時應(yīng)注意標(biāo)明： ◇ 動物品系； ◇ 染毒途徑； ◇ 95%可信限范圍。 LD50 ±1.96 S 例如：異氰酸甲酯 大鼠經(jīng)口 LD50值為69mg/kg±5.6 即63.4～74.6mg/kg。,,,概念： 局部毒性作用又稱局部損害作用，是指生物機體暴露于化學(xué)物后，在其接觸或暴露部位造成的局部毒性

29、損害作用，包括腐蝕性、刺激性與過敏性作用。 目的： 1.評價化學(xué)物對眼睛、皮膚的刺激與腐蝕作用和皮膚的致敏作用及其程度或等級； 2.為制定化學(xué)物安全使用規(guī)范提供科學(xué)依據(jù)。,第三節(jié) 局部毒性作用,一、眼睛刺激試驗 眼刺激性（eye irritation）指眼球表面接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性變化。 眼腐蝕性（eye corrosion）指眼球表面接觸受試物后引起的不可逆性組織損傷 。

30、 試驗方法：Draize 法（1944年） 常用動物：白兔,,,Draize 法： （自身對照原則） 試驗方法：一般采用4只白兔，受試物以一次劑量滴入每只實驗動物的一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)（0.1ml），以生理鹽水處理另一側(cè)眼作為自身對照。在規(guī)定的時間內(nèi)觀察對兔眼的刺激和腐蝕作用程度，并按規(guī)定的分級標(biāo)準(zhǔn)進行評分。 觀察指標(biāo)：結(jié)膜(發(fā)紅、球結(jié)膜水腫和分泌物)，角膜(混濁程度和范圍)，虹膜(充血、腫脹

31、和角膜周圍充血)。 實驗期限：一般為7天，必要時延長至21天(觀察期能足已評價刺激是否存在可逆性)。 注意事項： 如72h眼刺激反應(yīng)仍不消退時，需另取4只白兔觀察洗眼效果，即滴入受試物后分別在4s和30s時，用生理鹽水洗眼5min，觀察洗眼后的眼睛反應(yīng)。（洗眼效果試驗）,Draize 法眼損傷程度評分表：,（續(xù)表）,,眼睛刺激動物試驗替代法： 1.受精雞卵尿囊絨膜試驗 利用尿囊絨膜與結(jié)

32、膜結(jié)構(gòu)相似性。 2.細胞膜損傷溶血試驗 用分光光度計法測定溶血程度（Hb從RBC漏出）。 3.血紅蛋白變性試驗（用酶標(biāo)儀測定） 因角膜透明度降低是化學(xué)物破壞了蛋白質(zhì)構(gòu)象。 4.細胞毒性試驗 兔眼角膜上皮細胞SIRC模型，觀察細胞增殖、膜完整性等（中性紅不能沉積在死細胞內(nèi)，用酶標(biāo)儀測定） 5.生物膜替代法等方法 受試物+立體人類皮膚+MTT，用酶標(biāo)儀測定提取液

33、中的MTT吸光度（MTT不能沉積在死細胞內(nèi)）,二、皮膚刺激試驗 皮膚刺激性（dermal irritation）指皮膚接觸或涂敷受試物后，局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。 皮膚腐蝕性(dermal corrosion）指皮膚接觸或涂敷受試物后，引起局部的不可逆性組織損傷 。 皮膚刺激試驗類型： ①單次和多次皮膚刺激試驗； ②完整皮膚和破損皮膚刺激試驗等。 試驗方法：Draize

34、法（1944年） 常用動物：家兔或豚鼠,,,破損皮膚刺激試驗 是人為將動物皮膚某部位擦傷（不能傷及真皮和產(chǎn)生出血），以比較受試物對完整皮膚及受損皮膚造成的刺激反應(yīng)的差異。 傷口消毒藥物一般都需要做破損皮膚刺激試驗。,皮膚刺激試驗（Draize 法）： （自身對照原則） 試驗方法： 將受試物一次或多次涂敷于受試動物背部一側(cè)皮膚上(0.5ml)，涂敷持續(xù)時間一般為4h，以生理鹽水處理另一側(cè)背部皮膚

35、作自身對照。 觀察指標(biāo)： 皮膚反應(yīng)常為紅斑或紫紅色斑、水腫等，損傷嚴(yán)重時可形成焦痂，一般按紅斑和水腫的嚴(yán)重程度評分，并與自身對照比較，從而評價受試物對皮膚的刺激作用。 實驗觀察期：一般為14天。,皮膚刺激試驗結(jié)果的影響因素： 1.皮膚的完整性（皮膚受損程度）； 2.固態(tài)受試物的物理狀態(tài)與溶解度； 3.受試動物年齡與性別； 4.實驗人員主觀因素（存在判斷差異）等。無需做皮膚刺激試驗

36、條件： ①受試物為強酸或強堿類腐蝕性物質(zhì)（pH≤2或≥11.5） ②受試物有很強的經(jīng)皮吸收毒性，經(jīng)皮LD50小于200 mg/kg體重； ③急性經(jīng)皮毒性試驗中，受試物劑量達2000mg/kg體重仍未出現(xiàn)皮膚刺激性作用。,,皮膚刺激/腐蝕的體外替代法： 1.單層皮膚細胞培養(yǎng)模型 單層細胞培養(yǎng)技術(shù) （如：皮膚角質(zhì)形成細胞、皮膚黑色素細胞、皮膚成纖維細胞等） 2.表皮組織培養(yǎng)

37、模型 EpidermTM重組人表皮模型（美國） 3.器官型人工皮膚模型 即體外構(gòu)建的含表皮和真皮雙層結(jié)構(gòu),Draize 法皮膚損傷程度評分表：,,,,,三、皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗 皮膚變態(tài)反應(yīng)（skin sensitization） 是皮膚對化學(xué)物產(chǎn)生的免疫源性皮膚反應(yīng)，又稱過敏性接觸性皮炎或皮膚致敏反應(yīng)。 在人身上有瘙癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰等，在實驗動物身上，通常只能見

38、到皮膚紅斑和水腫等反應(yīng)。 試驗?zāi)康模捍_定重復(fù)接觸化學(xué)物是否可引起變態(tài)反應(yīng)及其反應(yīng)程度。 受試動物：豚鼠，每組動物10~20只。 實驗設(shè)計：需做陽性對照和陰性對照，陰性對照動物僅給予受試物激發(fā)接觸。（陽性物-2,4-二硝基氯苯）,致敏機制： 化學(xué)物在穿透皮膚的過程中，可作為半抗原與體內(nèi)某些特定的載體蛋白共價結(jié)合，形成完全抗原，誘導(dǎo)抗體形成，產(chǎn)生免疫記憶，如再次接觸較低濃度的相同或結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)物，即能引發(fā)皮

39、膚變態(tài)反應(yīng)。 試驗方法： ① 局部封閉涂皮法（Buehler Test）（傳統(tǒng)方法） ② 豚鼠最大值試驗（guinea pig maximization test） 用完全福氏佐劑，皮內(nèi)注射。 ③ 局部淋巴結(jié)試驗（local lymph node assay，LLNA） 實驗記錄： 記錄皮膚具有紅斑和水腫（過敏反應(yīng)）的動物數(shù)。,,局

40、部封閉涂皮法（二步法） 致敏接觸： 實驗前將受試動物背部左側(cè)皮膚去毛區(qū)3cm×3cm，將受試物0.1~0.2ml涂在2cm×2cm濾紙上，將其敷貼在去毛區(qū)，用兩層紗布，一層油紙或不透水塑料膜覆蓋，再以無刺激膠布固定，持續(xù)6h，6h后去除敷貼及受試物。第7天和第14天以同樣方法重復(fù)一次。 激發(fā)接觸： 實驗前將受試動物背部右側(cè)皮膚去毛區(qū)2cm×2cm。末次致敏后14~28天，將

41、0.1~0.2ml或低于致敏濃度的受試物斑貼于右側(cè)去毛區(qū)，覆蓋方法同前，持續(xù)6h，去掉斑貼及受試物后，每日觀察至第12天。,,一、概述 重復(fù)多次接觸化學(xué)物的毒性研究。 根據(jù)持續(xù)時間分類（按OECD）： 短期毒性作用（亞急性） （染毒期一般為28天） 亞慢性毒性作用 （嚙齒類動物一般為90天，犬為1年） 慢性毒性作用

42、 （嚙齒類動物一般為1年，或終身染毒）,第四節(jié) 短期、亞慢性和慢性毒性作用,,短期、亞慢性和慢性毒性試驗的主要目的： 1.觀察長期接觸受試物的毒效應(yīng)譜、毒作用特征與毒作用靶器官以及中毒表現(xiàn)（包括癥狀與體征）等； 2.探索受試物的作用機制； 3.觀察長期接觸受試物所致毒作用的可逆性； 4.評價毒作用的劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，確定最大無作用劑量（NOAEL）、閾劑量（LOAEL），為制訂人類基礎(chǔ)的安全

43、限值提供依據(jù)； 5.觀察不同動物種屬的毒性差異，為試驗結(jié)果外推到人，確定安全系數(shù)提供依據(jù)。,,,,,二、研究方法（一）短期重復(fù)毒性和亞慢性毒性試驗基本要求： 1.實驗動物的選擇 （1）物種與品系 ①嚙齒類動物（首選大鼠，品系Wister與SD大鼠） ②非嚙齒類動物（犬，品系Beagle） （2）性別、年齡和動物數(shù) 雌雄各半；大鼠年齡一般≯6周，體重50-100克，每組動物≮20只

44、。犬用4-6月齡(≯9個月)，每組動物≮8只。 （3）動物等級與飼養(yǎng)條件 清潔級及以上等級動物，屏障環(huán)境飼養(yǎng)，飼料、飲水、墊料、氣溫、氣濕、壓力、光照等符合GLP要求。,2.染毒途徑與染毒期限 應(yīng)盡量與人實際接觸相似的途徑；染毒頻率一般為每日1次，連續(xù)給予（每周可給予5-6次） （1）經(jīng)口染毒 ①灌胃法-大小鼠 ②喂飼法-大小鼠（受試物在飼料一般≯5%） ③吞咽膠囊法-犬

45、 （2）呼吸道染毒 每天染毒時間2-6小時（OECD：為持續(xù)4小時染毒） （3）注射途徑 應(yīng)注意無菌操作 染毒期限：短期重復(fù)暴露-28天；亞慢性暴露-90天,3.劑量選擇與分組 一般選擇至少3個劑量組和1個陰性對照組（溶劑），若要中期觀察或?qū)嶒灲Y(jié)束后恢復(fù)期觀察，對照組與高劑量組需設(shè)計“衛(wèi)星組”。 劑量組設(shè)計原則： ①高劑量組動物應(yīng)有明顯中毒反應(yīng)，但不引起死亡； ②中

46、劑量組動物出現(xiàn)輕度的中毒反應(yīng)； (相當(dāng)于LOAEL水平) ③低劑量組動物無毒性反應(yīng)； （相當(dāng)于NOAEL水平） ④劑量組間距一般為2-4倍。,劑量組設(shè)計應(yīng)注意的問題： ①以急性毒性試驗中同一動物品系和同一染毒途徑獲得的LD50為依據(jù)； 如28天經(jīng)口毒性試驗可按LD50的10-25%作為最高劑量，最低劑量應(yīng)是人體預(yù)期實際攝入量3倍以上。 ②對于求不出LD50的受試物

47、，即毒性很低的受試物，如藥品、食品，可根據(jù)人體實際攝入量為依據(jù)。 藥品：大鼠可用人臨床擬用劑量的10、30、100倍，非嚙齒類動物可用5、15、50倍的劑量進行劑量設(shè)置； 食品：試驗劑量應(yīng)涵蓋人體預(yù)期攝入量的100倍，在不影響營養(yǎng)攝食與營養(yǎng)平衡情況下，高劑量組可按最大給予量設(shè)計。,4.觀察指標(biāo)選擇 應(yīng)能觀察到受試物的靶器官和敏感毒性指標(biāo)。 ① 一般觀察指標(biāo)（中毒癥狀）； ② 體重、食物消耗

48、量與飲水消耗量； ③ 眼部觀察； ④ 血液學(xué)指標(biāo)； ⑤ 血液生化指標(biāo)； ⑥ 尿常規(guī)指標(biāo)； ⑦ 體溫與心電圖檢查； ⑧ 病理學(xué)檢查（大體解剖與組織病理學(xué)檢查）； ⑨ 特異性指標(biāo)（效應(yīng)標(biāo)志物）。,5.觀察時間 如果設(shè)計恢復(fù)期觀察： 28天亞急性毒性試驗：衛(wèi)星觀察期14天； 90天亞慢性毒性試驗：衛(wèi)星觀察期28天； 觀

49、察目的： ① 毒性可逆性； ② 毒性持續(xù)性； ③ 毒性遲發(fā)效應(yīng)等； 觀察要求： 至少每天觀察一次，詳細記錄中毒癥狀、體征、毒 效應(yīng)性質(zhì)、毒性持續(xù)時間、死亡等情況。,（二）慢性毒性試驗試驗?zāi)康模?評價受試動物大部分生命期間給予受試物所發(fā)生慢性毒性效應(yīng)，闡明其劑量-反應(yīng)關(guān)系和靶器官，確定慢性毒性的NOAEL和LOAEL。 根據(jù)“3R”原則，慢性毒性試驗與致

50、癌試驗合并。 1.實驗動物與染毒途徑選擇（與亞急性與亞慢性相同） 2.染毒劑量與染毒期限 一般選擇至少3個劑量組和1個陰性對照組（溶劑），若要中期觀察或?qū)嶒灲Y(jié)束后恢復(fù)期觀察，對照組與高劑量組需設(shè)計“衛(wèi)星組”。劑量組距一般為2-4倍，≯10倍。染毒期限一般至少12個月。 3.觀察指標(biāo)選擇（同亞慢性試驗）,（三）實驗結(jié)果評價 （短期、亞慢性與慢性毒性結(jié)果）評價要求： 確定受試

51、動物發(fā)生毒效應(yīng)的劑量-反應(yīng)關(guān)系和靶器官，求得NOAEL和LOAEL。 要與正常對照組比較，作統(tǒng)計學(xué)處理分析： 1.劑量-效應(yīng)（反應(yīng)）關(guān)系趨勢； 2.實驗效應(yīng)重現(xiàn)性（毒性“三個重現(xiàn)”）； 3.相關(guān)指標(biāo)變化分析； 4.毒性的性別差異； 5.持續(xù)效應(yīng)趨勢分析； 6.效應(yīng)差異大??； 7.實驗室的歷史對照分析（有助于排除假陽性）,,毒理學(xué)研究的實際意義： 如食品

52、安全性毒理學(xué)評價中90天喂養(yǎng)試驗： 1.最大無作用劑量(NOAEL)≤人可能實際攝入量100倍，表示毒性較強，應(yīng)放棄該化學(xué)物用于食品； 2.最大無作用劑量(NOAEL)在人可能實際攝入量100-300倍時，應(yīng)進行慢性試驗； 3.最大無作用劑量(NOAEL)≥人可能實際攝入量300倍時，不必進行慢性試驗，即可進行安全性評價。,,又如工業(yè)化學(xué)物毒物的慢性毒性試驗： 1.LOAEL與NOAEL值越小，慢性

53、中毒的危險性越大，制定安全限值（衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)）應(yīng)越嚴(yán)格（即安全系數(shù)要大）。 2.慢性吸入中毒危險指數(shù) （Rchip=20℃毒物蒸汽飽和濃度/Limch）評價危險性大?。?Rchip＜100 輕微危害 100≤Rchip＜1000 中等危害 1000≤Rchip＜10000 高度危害 Rchip＞10000 極高危害,,蓄積毒性試

54、驗研究意義： 1.求出蓄積系數(shù)(K)，判斷化學(xué)藥物蓄積性大??； 2.為其他相關(guān)毒性試驗的劑量設(shè)計提供依據(jù)。基本方法： 1.理化檢驗法 -（物質(zhì)蓄積，求t1/2）　　?。埩袈蕼y定法） 2.生物效應(yīng)法 -（物質(zhì)蓄積與功能蓄積） ①蓄積系數(shù)法（有固定劑量法與遞增劑量法） ②20天蓄積試驗法,,蓄積系數(shù)法 蓄積系數(shù)是指多次染毒所產(chǎn)生的毒

55、效應(yīng)(ED50(n)或LD50(n))與一次染毒所產(chǎn)生相同毒效應(yīng)(ED50(1)或LD50(1))的比值。 公式： Kacc=ED50(n)/ED50(1) 或Kacc=LD50(n)/LD50(1) 求出蓄積系數(shù)K值。根據(jù)K值的大小判斷化學(xué)物蓄積作用的強弱，K值越小蓄積毒性越大。,,,,1.固定計量法 基本方法： ①求出化學(xué)物1次染毒的LD50(1)值；

56、 ②對另一組動物每天給予1/10 LD50(1)劑量直至受試動物死亡一半為止，計算所用總劑量即LD50(n)； ③如果到50天死亡動物仍未達一半，停止試驗（達5個LD50(1)劑量），這時可判斷為輕度蓄積作用。,,,2.遞增劑量法 基本方法： ①求出化學(xué)物1次染毒的LD50(1)值； ②測定另一組動物L(fēng)D50(n)； 以4天為一周期，在同一周期劑量相同，下一周期為上一周期劑量的1.5倍

57、，第一周期每天劑量為0.1 LD50(1)，直至受試動物死亡一半為止，計算總劑量即LD50(n)； ③如果到28天，死亡動物仍未達一半，可停止試驗，這時總劑量達12.8LD50(1),可認(rèn)為無蓄積性。,,劑量遞增法(1.5倍)使用劑量表 接觸天數(shù) 1~4 5~8 9~12 13~16 17~20 21~24 25~28

58、 每日接觸劑量(LD50) 0.1 0.15 0.22 0.34 0.50 0.75 1.12 4日接觸總劑量(LD50) 0.4 0.6 0.88 1.36 2.00 3.00 4.48  累積接觸總劑量(LD50) 0.4

59、1.0 1. 88 3.24 5.24 8.24 12.72,,,,,,,,,如本周期受試動物死亡一半 即LD50（n）=3.24mg/kg,,我國農(nóng)藥蓄積性評定標(biāo)準(zhǔn) 蓄積系數(shù)(K) 蓄積毒性分級 ＜1 高度蓄積性 1~

60、 明顯蓄積性 3~ 中等蓄積性 5~ 輕度蓄積性,,,,結(jié)果評價,,我國消毒劑蓄積性評定標(biāo)準(zhǔn) 蓄積系數(shù)(K) 蓄積毒性分級 ＜1 極強蓄積性

61、 1? 強蓄積性 3? 中等蓄積性 5? 弱蓄積性,,,,,20天蓄積總量 實驗組 累積劑量 1/20LD50（低劑量組） LD50 1/10LD50 2 LD50 1/5LD5

62、0 4 LD50 1/2LD50 （高劑量組） 10 LD50 對照組 0,,,,20d蓄積試驗法,,結(jié)果評價,20天蓄積試驗法評定標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)果表述 蓄積毒性分級停藥后7d，各劑量組無死亡動物 未見蓄積性高劑量組有動物死亡，其他組無動物死亡

63、弱蓄積性低劑量組無動物死亡，其他組有動物死亡 中等蓄積性各劑量組有動物死亡，并呈劑量反應(yīng)關(guān)系 強蓄積性,,,,,耐受性試驗 當(dāng)累積劑量＞5個LD50，受試動物死亡仍未達一半時： 1.說明蓄積性極低； 2.提示機體對毒物產(chǎn)生耐受性。耐受性檢驗： 在蓄積性試驗基礎(chǔ)上，給予1個LD50打擊劑量，此時受試動物死亡仍未達一半時，可被認(rèn)為出現(xiàn)耐受性。 有時給予3個LD50打擊劑量