利用PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)、鑒定乳酸菌.pdf

1、乳酸菌廣泛存在于人和動(dòng)物腸道、植物表面等生境中。作為最具代表性的益生菌，乳酸菌在食品發(fā)酵、飲品和飼料等領(lǐng)域有著悠久的應(yīng)用歷史。將分子生物學(xué)方法引入微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，研究乳酸菌制品中不同乳酸菌及其菌群組成，可以獲得發(fā)酵過程中乳酸菌菌群組成的動(dòng)態(tài)變化。這對(duì)于生產(chǎn)過程的控制、產(chǎn)品質(zhì)量的檢驗(yàn)具有重要意義。本文中采用PCR-DGGE(ploymerase chain reaction anddenaturing gredient gel elec

2、trophoresis，PCR-DGGE)技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)的平板分離培養(yǎng)，對(duì)一些包含有乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行微生物菌群分析，建立了一種快速檢測(cè)乳酸菌的方法。 對(duì)PCR-DGGE技術(shù)在分析乳酸菌制劑中的有關(guān)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行探索及優(yōu)化。首先對(duì)變性梯度凝膠濃度及電泳時(shí)間進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在進(jìn)行平行DGGEB時(shí)，變性劑(尿素及甲酰胺)濃度在30％～55％時(shí)，能夠有效分離大小相同、堿基組成不同的DNA片斷。時(shí)間間歇變性梯度凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

3、示，對(duì)乳酸菌16srDNA可變區(qū)的最佳分離時(shí)間為200min。通過DGGE法分析了細(xì)菌通用引物在PCR擴(kuò)增不同模板時(shí)的產(chǎn)物差異，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物量與模板量并沒有直接關(guān)系，推測(cè)主要是引物與模板的結(jié)合效率有關(guān)。在優(yōu)化的電泳條件下，選擇微生物飼料添加劑中常用的7株益生乳酸菌，建立了它們的DGGE指紋圖譜庫。 以青貯玉米秸稈飼料為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)從發(fā)酵產(chǎn)品中直接提取總DNA的方法及其效率進(jìn)行研究。結(jié)果表明，采用先分離青貯飼料中微生物，再進(jìn)行溶菌

4、酶與SDS共同作用裂解細(xì)胞的方法，所提取的青貯飼料總DNA純度較高。用PCR和光吸收方法對(duì)所得的DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)得到的DNA中雜質(zhì)含量少，可用于后續(xù)的分子操作。通過DGGE對(duì)提取的DNA進(jìn)行純度及效率的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)所建立的方法能提取出青貯飼料中所有優(yōu)勢(shì)菌群的染色體DNA，沒有遺漏。通過向滅菌秸稈中接種不同濃度的已知菌株干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，驗(yàn)證上述方法的可靠性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在樣品中不少于75個(gè)微生

5、物的。DNA均可被提取出來，采用PCR的方法，檢測(cè)出了加入材料中的很少量的目標(biāo)菌株，證明所建立的提取DNA的方法有較高的靈敏度。 益生菌劑EM(effective microorganisms，EM)是一種被廣泛應(yīng)用于飼料加工、生物肥料等領(lǐng)域的一種由多種微生物組成的活菌制劑。利用平板計(jì)數(shù)檢測(cè)EM中的活菌數(shù)，和顯微鏡觀察其微生物的個(gè)體形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EM制劑中活菌數(shù)量較多，達(dá)到2x10<'7>cfu/mL，細(xì)胞形態(tài)多樣，并從MRS、

6、LB平板上分離到形態(tài)有差異的6株細(xì)菌。利用DGGE技術(shù)對(duì)這6株細(xì)菌進(jìn)行鑒定，其結(jié)果是6株細(xì)菌屬于3類，分別是蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、嗜熱鏈球菌(Str.Thermophilus)和大腸桿菌(Escherichia coli)。直接提取EM制劑的總DNA，利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)EM細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EM中含有4類優(yōu)勢(shì)乳酸菌。將益生菌劑EM分別在LB培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接5次后，分析乳酸菌的

7、組成變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩種培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后EM中乳酸菌的種類大大減少。 利用傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)、平板分離純化方法，對(duì)國內(nèi)6種市售酸奶的乳酸菌及其組成進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，所有酸奶樣品中的活菌數(shù)量都在10<'6>cfu/ml以上，均達(dá)到國標(biāo)中規(guī)定的要求；并且從酸奶中均分離出2種形態(tài)明顯不同的桿菌和鏈球菌。對(duì)其進(jìn)行16S rDNA核酸序列測(cè)定及同源性比對(duì)分析，這2種菌被鑒定為德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrue

8、ckii)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)。利用引物L(fēng)aclGC和HDA2擴(kuò)增不同酸奶中乳酸菌16S rRNA基因的可變區(qū)域，進(jìn)行PCR-DGGE直接分析，結(jié)果表明，酸奶樣品yld中含有螺旋乳桿菌和鼠李糖乳桿菌，樣品jb中只檢測(cè)到德氏乳桿菌，而其它酸奶樣品中同時(shí)含有德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌，而嗜熱鏈球菌在DGGE凝膠上的帶較淺。當(dāng)用引物R518和F357進(jìn)行PCR-DGGE直接分析時(shí)，除了樣品yld外，其