利用PCR-DGGE技術(shù)分析病死豬堆肥過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)和種類特征.pdf

1、集約化養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展的同時(shí)，也造成來(lái)自畜禽糞便、污水以及病死畜禽殘?bào)w的嚴(yán)重污染。相對(duì)于畜禽糞便對(duì)環(huán)境的污染，死畜禽由于攜帶大量的病原微生物，如果不及時(shí)處理，對(duì)人和動(dòng)物的危害更大更直接。據(jù)統(tǒng)計(jì)，養(yǎng)殖場(chǎng)的畜禽死亡率在5％～10％之間，而生豬的死亡率在8％～12％之間，遇到重大疫情，死亡率還會(huì)升高。因此，對(duì)死畜禽進(jìn)行無(wú)害化處理是解決環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)畜牧業(yè)良性發(fā)展的必由之路。
　　堆肥是一個(gè)可被生物降解的有機(jī)質(zhì)堆，通過(guò)好氧微生物分解成穩(wěn)定的

2、、類似土壤的腐殖質(zhì)過(guò)程。病死豬堆肥相對(duì)于傳統(tǒng)的死豬處理方法，如，掩埋、焚燒、高溫熬煮等，具有更加安全和環(huán)保的優(yōu)勢(shì)。堆肥過(guò)程的物質(zhì)轉(zhuǎn)化歸根到底是由堆肥體系中微生物的代謝活動(dòng)來(lái)完成。因此充分了解病死豬堆肥體系中微生物的菌群種類和動(dòng)態(tài)分布，挖掘病死豬堆肥體系的優(yōu)勢(shì)微生物，為開發(fā)病死豬堆肥微生物菌劑，促進(jìn)腐熟進(jìn)程，縮短堆肥周期奠定基礎(chǔ)。
　　本研究通過(guò)開展6個(gè)月為一個(gè)堆肥周期的病死豬尸體自然發(fā)酵試驗(yàn)，檢測(cè)了堆肥過(guò)程不同階段的理化參數(shù)，利用

3、PCR-DGGE技術(shù)分析了堆肥過(guò)程不同階段的微生物種類，構(gòu)建了系統(tǒng)樹。分離和篩選出5株高溫優(yōu)勢(shì)菌，并通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)和16s rRNA測(cè)序?qū)@5株優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行了初步鑒定。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病死豬堆肥不同階段不同高度的溫度變化，對(duì)不同階段的樣品含氮量、含水率、pH值、有機(jī)質(zhì)含量、有效活菌數(shù)、蛔蟲死亡率、重金屬含量和類大腸桿菌數(shù)理化參數(shù)進(jìn)行測(cè)定和分析。堆肥試驗(yàn)中堆體溫度的變化經(jīng)歷了典型的升溫期、高溫期、降溫期三個(gè)階段

4、，且堆體上、中、下三層溫度的變化趨勢(shì)基本是一致的，前3個(gè)月是有機(jī)質(zhì)降解階段，微生物活動(dòng)頻繁，中層溫度近70℃;pH變化遵循先下降-再升高-再下降的進(jìn)程趨勢(shì)。堆肥結(jié)束，病死豬尸體軟組織全部降解，堆料腐熟，外觀成黑色顆粒如腐殖質(zhì)，依稀可見骨頭和牙齒，但這些難降解物質(zhì)很脆，容易捏碎。氮含量為5.3％左右，有機(jī)質(zhì)含量為53％，大腸桿菌值低于100個(gè)/g，蛔蟲卵殺滅率接近于100％，有效活菌數(shù)接近于0.35億/g，堆體周圍沒有活的蛆、蛹或新羽化的

5、成蠅，達(dá)到了《糞便無(wú)害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB7959-87)》的規(guī)定。
　　(2)提取了微生物基因組總DNA，完成了16s rRNA V6～V8區(qū)片段的PCR擴(kuò)增。通過(guò)變形梯度凝膠電泳，得到了18個(gè)樣品的DGGE圖譜。通過(guò)QuantityOne軟件分析DGGE圖譜發(fā)現(xiàn)，各個(gè)時(shí)期的細(xì)菌豐富度都比較高。前三個(gè)月的細(xì)菌的分布比較凌亂，后三個(gè)月的細(xì)菌分布趨于穩(wěn)定。致病菌只在前三個(gè)月存在，后三個(gè)月致病菌被殺死。分別對(duì)切膠回收后的45條優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序

6、，并與已知序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)，得到了這45條序列的詳細(xì)結(jié)果并完成了它們的系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堆肥過(guò)程中存在大量未知細(xì)菌，它們?cè)诙逊蔬^(guò)程中的作用還有待探究。堆肥過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus lincheniformis）、枝芽孢桿菌（Virgibacillus）和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。
　　(3)傳統(tǒng)培養(yǎng)并

7、結(jié)合高溫處理，分離獲得了5株優(yōu)勢(shì)菌。通過(guò)生理生化鑒定、顯微鏡形態(tài)觀察和16s rRNA測(cè)序，結(jié)果顯示，J1為未知菌與已知的Unculturedbacterium clone(JF155193)相似率為98％，J2、J3和J5為Bacillus subtillis strain，J4為Bacillus thuringiensis strain。產(chǎn)淀粉酶酶活性由強(qiáng)至弱依次為J4，J1，J2，J3，J5，產(chǎn)蛋白酶活性由強(qiáng)至弱依次為J1， J5