應(yīng)用PCR-DGGE和rep-PCR技術(shù)對大鼠及成人肝硬化肝移植后腸道菌群多樣性的研究.pdf

1、研究目的:
　　 肝移植是目前各種急、慢性終末期肝病及肝衰竭最有效的治療手段。感染和排斥,仍是肝移植術(shù)后最常見的兩大并發(fā)癥。由于肝臟與腸道不僅在解剖結(jié)構(gòu),而且在功能上有著密切的聯(lián)系,腸道作為人體最大的貯菌庫和內(nèi)毒素庫,在特定條件下可以釋放多種毒性物質(zhì),導(dǎo)致腸源性感染的發(fā)生,并加重肝臟的損害。肝硬化患者腸道菌群發(fā)生明顯的易位,革蘭陰性需氧菌明顯增多,以腸桿菌科細(xì)菌為主,厭氧菌如雙歧桿菌和乳酸桿菌減少,但肝硬化肝移植術(shù)后腸道菌群的多

2、樣性變化鮮有報(bào)道。腸道微生態(tài)失衡、腸黏膜屏障損傷和腸滲透性增加、免疫功能失調(diào)及手術(shù)缺血再灌注損傷等均是造成肝移植后腸道菌群變化的重要原因。本研究應(yīng)用基于16S rRNA特異性基因的指紋圖譜分析(PCR-DGGE)、屬特異性引物Real-time PCR對大鼠及成人肝移植后腸道菌群的多樣性進(jìn)行研究,并嘗試應(yīng)用細(xì)菌基因組間重復(fù)序列的DNA指紋圖譜(rep-PCR)技術(shù)對腸道菌群多樣性變化進(jìn)行初步研究,探討大鼠及成人肝硬化肝移植后腸道菌群多樣

3、性的變化,觀察腸道菌群變化的規(guī)律,優(yōu)化腸道微生態(tài),預(yù)防肝移植后感染的發(fā)生,為肝硬化、肝移植患者的治療和預(yù)后提供一定的參考價(jià)值。
　　 材料和方法:
　　 1、成功建立CCL4誘導(dǎo)的SD大鼠肝硬化模型,選擇健康的SD大鼠對肝硬化模型組進(jìn)行肝移植,采集正常對照組、肝硬化模型組、肝硬化肝移植術(shù)后7d組、肝硬化肝移植術(shù)后30 d組的糞便標(biāo)本,于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、收集健康成人、肝炎肝硬化患者、肝移植術(shù)后患者

4、的糞便標(biāo)本,于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 3、提取上述各組糞便細(xì)菌基因組DNA,然后用16S rDNA V3區(qū)通用引物擴(kuò)增細(xì)菌總DNA,對擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)。
　　 4、應(yīng)用腸道優(yōu)勢菌群屬特異性引物,進(jìn)行6種細(xì)菌的Real-time PCR檢測,明確這6種優(yōu)勢細(xì)菌在大鼠和成人肝硬化肝移植后腸道中的變化情況。
　　 5、利用細(xì)菌基因組內(nèi)重復(fù)序列引物包括BOX-PCR,ERIC-PCR,

5、ERIC2-PCR,(GTG)5-PCR,REP-PCR對大鼠及成人糞便細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增電泳,分析指紋圖譜。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功建立了SD大鼠肝硬化模型(造模組大鼠肝臟病理見假小葉形成),并對其成功進(jìn)行了肝移植,移植后SD大鼠1只出血死亡,其余排斥反應(yīng)較輕,移植組大鼠生活良好。
　　 2、PCR-DGGE圖譜分析可明確將大鼠及成人正常對照組、肝硬化組、肝移植組均分為3個(gè)簇,并顯示出大鼠肝硬化、肝

6、移植后腸道菌群多樣性明顯增多,而成人肝硬化、肝移植后腸道菌群多樣性有所減少,肝硬化發(fā)生過程中,腸道菌群中優(yōu)勢菌群如擬桿菌屬(Bacteroides)的數(shù)量減少,腸桿菌科細(xì)菌如Prevotella菌等數(shù)量增多,肝移植后菌群多樣性變化有所恢復(fù),但仍未回到正常水平。
　　 3、Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,肝硬化大鼠中擬桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬細(xì)菌明顯減少,腸球菌屬、腸桿菌屬細(xì)菌明顯增加。而成人中肝硬化組梭菌屬

7、、雙歧桿菌屬細(xì)菌明顯減少,而腸球菌屬細(xì)菌明顯增加。
　　 4、rep-PCR技術(shù)也可將大鼠及成人正常對照組、肝硬化組、肝移植組區(qū)分開,其中ERIC-PCR、ERIC2-PCR及REP-PCR-三者擴(kuò)增條帶各組差異顯著,鑒別效果更好。
　　 5、PCR-DGGE主要分析腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群的多樣性,可明確腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群的種類變化。rep-PCR技術(shù)將腸內(nèi)菌群作為整體,研究微生物菌群多樣性的整體變化。rep-PCR和PCR-DGG

8、E技術(shù)在大鼠及成人肝硬化肝移植后腸道微生態(tài)的研究中具有相似的鑒別力,但PCR-DGGE的分辨率更好。
　　 結(jié)論:
　　 SD大鼠及成人肝硬化后肝移植的腸道菌群多樣性發(fā)生明顯變化,其中以肝硬化組變化最為明顯,肝移植術(shù)后腸道菌群有向正?；謴?fù)的趨勢。應(yīng)用rep-PCR和PCR-DGGE技術(shù)一樣,均可將肝移植前后腸道菌群多樣性差異分辨出,尤其是ERIC-PCR、ERIC2-PCR及REP-PCR鑒別效果更好,可為監(jiān)測菌群多樣性