應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對不同日齡仔豬腸道菌群分布規(guī)律的研究.pdf

1、胃腸道菌群是機(jī)體的重要組成部分，其種類繁多，數(shù)量龐大，約有30多個(gè)屬500多種細(xì)菌，大約1×1014個(gè)活細(xì)菌，比機(jī)體細(xì)胞總數(shù)還多10倍。正常菌群是動(dòng)物生存的必要條件，其結(jié)構(gòu)多樣性及種群結(jié)構(gòu)的變化與機(jī)體的健康和疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。PCR-DGGE是基于16SrDNA的可變區(qū)PCR擴(kuò)增的序列特異性熔鏈溫度不同進(jìn)行分離的，并且可以檢測出序列中一個(gè)核昔酸的差異。因此通過該技術(shù)直接擴(kuò)增16SrDNA的可變區(qū)，構(gòu)建DNA指紋圖譜，建立快速檢

2、測的分子分型平臺，能廣泛用于腸道復(fù)雜微生物區(qū)系菌群結(jié)構(gòu)演替和多樣性分析研究，是目前應(yīng)用于胃腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性和種群結(jié)構(gòu)變化研究的一種較為廣泛的分子生物學(xué)方法。 本文利用變性梯度凝膠電泳（DenaturingGardientGelElectrophoresis，DGGE）技術(shù)，對兩窩（A、B兩組）共16頭不同時(shí)間段（0、1、3、9、15、21、28、35日齡）健康仔豬的十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸中細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)多樣性和

3、動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了檢測，為今后對仔豬腸道菌群的進(jìn)一步研究奠定一定的實(shí)踐基礎(chǔ)，本課題建立出一套適用于實(shí)驗(yàn)室研究動(dòng)物腸道細(xì)菌多樣性的DGGE檢測方案。首先應(yīng)用DGGE技術(shù)分析仔豬腸道細(xì)菌的多樣性，了解仔豬腸道菌群的時(shí)空變化規(guī)律，并尋找出一部分優(yōu)勢菌群；然后對共有條帶和特殊條帶進(jìn)行回收、克隆并測序，利用Blast工具將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對，找出與其同源性最高的DNA序列，并對序列進(jìn)行了分析。 采用DGGE技術(shù)

4、分析細(xì)菌多樣性時(shí)，凝膠濃度為7.15％，變性劑梯度范圍在30％-60％之間，恒溫60℃，85V電泳約12h左右，DGGE帶譜的分離效果較好。結(jié)果表明：小豬在出生后數(shù)小時(shí)（吃初乳前）就可以檢測到有少量細(xì)菌定植腸道，隨著小豬日齡的增長，各個(gè)腸段細(xì)菌種類和數(shù)量也逐漸增多，至3日日齡時(shí)細(xì)菌種類和數(shù)量已相當(dāng)豐富。隨后至9日齡、15日齡時(shí)小豬腸道內(nèi)細(xì)菌種類、數(shù)量逐漸變緩。至20日齡腸道內(nèi)細(xì)菌種類和數(shù)量有所增加，隨后28日齡又有所下降，至35日齡時(shí)各

5、個(gè)腸道細(xì)菌種類和數(shù)量逐漸趨于穩(wěn)定。其中十二指腸和空腸細(xì)菌種類和數(shù)量相對較少，盲腸和結(jié)腸最多。 通過對DGGE圖譜中一些共有以及特殊的條帶進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)：切膠回收的條帶所代表的細(xì)菌與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌有很高的同源性，大部分在90％以上，有的同源性甚至達(dá)到了100％。條帶A0-1與已鑒定的Clostridiumperfringens相似性為100％，表明仔豬出生數(shù)小時(shí)Clostridiumperfringens就已經(jīng)存在于仔豬的各段腸

6、道。A1-1與已鑒定的Escherichiacoli相似性為99％，表明仔豬出生一天后Escherichiacoli已經(jīng)成為各段腸道的優(yōu)勢菌群。此外在三日齡仔豬腸道內(nèi)檢測到Lactobacillusacidophilus和lactobacillusvaginalis。隨著仔豬日齡的增加，所能檢測的絕大部分都為不可培養(yǎng)細(xì)菌。說明在仔豬斷奶后期生長過程中，不可培養(yǎng)菌群、未經(jīng)鑒定的菌群和一些未知的菌群可能起重要作用。 在今后的研究中，