細(xì)胞穿膜肽Tat-FynP靶向抑制炎性痛大鼠NR2B磷酸化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、炎性疼痛是慢性疼痛產(chǎn)生的重要原因之一，人群患病率高，仍缺乏有效的治療手段。研究表明，中樞敏化是慢性炎性疼痛發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，其中脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)是介導(dǎo)炎性疼痛的關(guān)鍵分子，其通過亞基NR2B磷酸化過程介導(dǎo)中樞敏化，抑制NR2B磷酸化可以很好地緩解炎性疼痛癥狀，是治療慢性炎性疼痛的重要靶點(diǎn)。因NR2B參與多種生物過程，其抑制劑可產(chǎn)生多種不良反應(yīng)

2、和副作用，限制了臨床應(yīng)用，進(jìn)一步尋找抑制NR2B磷酸化的藥物和方法就成為目前研究的重點(diǎn)。研究表明，脊髓背角酪氨酸激酶Fyn SH2結(jié)構(gòu)域與突觸后致密物蛋白95（Postsynaptic density，PSD-95）PDZ3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合是促進(jìn)NR2B的磷酸化，介導(dǎo)慢性炎性疼痛發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。本課題組前期研究表明，通過多肽陣列技術(shù)明確了Fyn與PSD-95結(jié)合的短肽序列FynP，并利用蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)導(dǎo)域技術(shù)合成穿膜肽Tat-FynP，經(jīng)離體實(shí)

3、驗(yàn)證明Tat-FynP可競爭性抑制大鼠脊髓背角(Spinalcord dorsal horn，SCDH)原代神經(jīng)元Fyn與PSD-95的結(jié)合。
　　研究目的：
　　本研究在前期基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在體檢測鞘內(nèi)注射Tat-FynP是否可以競爭性抑制炎性痛大鼠SCDHFyn與PSD-95結(jié)合、降低NR2B磷酸化水平從而緩解炎性痛痛覺過敏行為，為臨床治療慢性炎性疼痛提供治療依據(jù)。
　　研究方法:
　　鞘內(nèi)給予大鼠組氨酸標(biāo)記的

4、多肽藥物，免疫組化檢測大鼠脊髓背角神經(jīng)元并對組氨酸陽性神經(jīng)元進(jìn)行計數(shù)評分，明確多肽藥物穿膜效率;免疫印跡檢測大鼠足底注射完全弗氏佐劑(Complete Freund's adjuvant，CFA)致脊髓背角NR2B磷酸化水平的時量變化趨勢;鞘內(nèi)注射Tat-FynP(突變序列Tat-mFynP作為對照)，免疫共沉淀檢測Tat-FynP對Fyn與PSD-95相互作用的影響;炎性痛大鼠鞘內(nèi)給予不同劑量的Tat-FynP，免疫印跡檢測Tat-F

5、ynP對NR2B磷酸化水平的影響，同時檢測Tat-FynP對CFA炎性痛大鼠機(jī)械性刺激縮足反應(yīng)閾值(Mechanical pawwithdrawal threshold，MWT)及熱刺激縮足潛伏期(Thermal paw withdrawallatency，TWL)等疼痛行為影響，進(jìn)一步觀察大鼠放置反射、抓握反射、翻正反射，以判斷大鼠有無運(yùn)動功能障礙。
　　研究結(jié)果:
　　與FynP組相比，Tat-FynP組及Tat-mFy

6、nP組大鼠脊髓背角組氨酸陽性神經(jīng)元評分明顯增高(P＜0.01)，而空白組與FynP組大鼠脊髓背角組氨酸陽性神經(jīng)元評分無明顯差異(P＞0.05)，表明具有Tat穿膜結(jié)構(gòu)的Tat-FynP及Tat-mFynP可有效穿過細(xì)胞膜進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi);與空白組大鼠比較，CFA可顯著刺激脊髓背角的NR2B(p-NR2B)磷酸化表達(dá)(P＜0.01)，CFA注射后24h達(dá)高峰，可至少維持14天;與對照組Tat-mFynP比較，Tat-FynP競爭性抑制Fyn與